הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר<em> באתר</em> 3D מיפוי של תכונות פיסיקליות biofilm חיידקים

Summary

מאמר זה מציג את המתודולוגיה מקורית המבוססת על actuation מרחוק של חלקיקים מגנטיים זורעים בbiofilm חיידקים וההתפתחות של פינצטה המגנטית ייעודית למדידה באתרו את התכונות מכאניות המקומיות של החומר החי המורכב שנבנה על ידי מיקרו אורגניזמים בממשקים.

Abstract

הידבקות חיידקים וצמיחה בממשקים להוביל להיווצרות של biofilms מבנים הטרוגנית תלת ממדים שנקרא. תאי מגורים במבנים אלה מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות פיזיות מתווכות על ידי רשת של חומרים פולימריים תאיים. biofilms חיידקים להשפיע על פעילות אנושית רבות וההבנה של המאפיינים שלהם היא קריטית לשליטה טובה יותר של ההתפתחות שלהם – תחזוקה או חיסול – תלוי בתוצאה השלילית או חיובית שלהם. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חדשנית במטרה למדוד באתרו את התכונות פיזיות המקומיות של biofilm שהיה, עד עכשיו, בדק רק מבחינה חומרית מקרוסקופית והומוגנית. הניסוי המתואר כאן כרוך בהחדרת חלקיקים מגנטיים לbiofilm גדל זרע בדיקות מקומיות שיכול להיות מופעלים מרחוק מבלי להפריע את המאפיינים המבניים של biofilm. פינצטה המגנטית ייעודי היתה developed להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק המוטבע בbiofilm. ההתקנה היא רכוב על הבמה של מיקרוסקופ כדי לאפשר ההקלטה של ​​תמונות של התקופה מושך חלקיקי זמן לשגות. אז מסלולי החלקיקים המחולצים הרצף מושך ופרמטרי viscoelastic המקומיים נגזרים מכל עקומת עקירת חלקיקים, וכך לספק את הפצת 3D-המרחבי של הפרמטרים. השגת תובנות הפרופיל המכני biofilm הוא חיוני מנקודת המבט של מהנדס למטרות בקרת biofilm, אלא גם מנקודת מבט בסיסית כדי להבהיר את הקשר בין המאפיינים האדריכליים והביולוגיה הספציפית של מבנים אלה.

Introduction

biofilms חיידקים הם קהילות של חיידקים הקשורים למשטחים ביולוגיים או מלאכותיים ^1-3. הם יוצרים על ידי מנגנון הידבקות צמיחה בשילוב עם הייצור של תאי מטריקס פוליסכריד עשיר שמגן ומייצב את המבנה ^4,5. biofilms אלה אינם מכלולים פשוט פסיביים של תאים נדבקו למשטחים, אבל מאורגן ומערכות ביולוגיות מורכבות דינמיות. כאשר חיידקים לעבור מפלנקטון לאורח החיים biofilm, שינויים בביטוי גנים ופיזיולוגיה של תאים הם נצפו, כמו גם התנגדות מוגברת לantimicrobials ולארח הגנה חיסונית להיות במקור של זיהומים מתמשכים וכרוניים רבים ^6. עם זאת, הפיתוח המבוקר של מבני חיים אלה מציעים גם הזדמנויות ליישומים תעשייתיים וסביבתיים, כגון bioremediation של אתרי פסולת מסוכנים, ביו סינון של מים או היווצרות של ביו מחסומים כדי להגן על קרקע ומי תהום מcontamin תעשייתייםation.

בעוד תכונות מולקולריות ספציפיות לדרך biofilm החיים מתוארות יותר ויותר, את המנגנונים המניעים את התפתחות הקהילה והתמדה עדיין אינם ברורים. שימוש בהתקדמות שחלה באחרונה במדידות microscale באמצעות אלקטרוכימיים סריקה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ארגוני חיים אלה הוכחו תערוכה ניכרת מבני, כימי וביולוגית ההטרוגניות ^7. עם זאת, עד עכשיו, מכניקת biofilm נבדק בעיקר macroscopically. למשל, התבוננות בסרטי biofilm עיוות עקב שינויים בשיעורי זרימת נוזל ^8,9, דחיסת uniaxial של חתיכות biofilm להרים ממדיום אגר או גדלה על הכיסוי מחליק ^10,11, גזירה של biofilm שנאסף מהסביבה ולאחר מכן הועבר למקביל rheometer צלחת ^12,13, ספקטרוסקופיה כוח אטומי באמצעות חרוז זכוכית ומצופה עם biofilm חיידקים מצורפים AFM שלוחה ¹⁴ או MICR ייעודישיטת ocantilever למדידת חוזק המתיחה של שברי biofilm מנותקים ^15,16 יושמו במהלך עשר השנים האחרונות, ומספקת מידע שימושי על טבע viscoelastic של החומר ^17. עם זאת, סביר להניח שמידע על תכונות מכאניות biofilm אתרו הולך לאיבוד כאשר החומר מוסר מהסביבה המקורית שלו, שהייתה קורים לעתים קרובות בגישות אלה. יתר על כן, הטיפול של biofilm כחומר הומוגני מחמיץ את המידע על ההטרוגניות האפשרית של התכונות פיזיות בקהילה. לכן, ההשלכות של מכניקת המבנה בהיווצרות biofilm ותכונות ביולוגיות כגון דפוסים ביטוי גנים או הדרגתיים כימי המדויקות בקושי יכולות להיות מוכרות. כדי להתקדם לכיוון תיאור microscale של התכונות פיזיות biofilm, כלים ייעודיים חדשים נדרשים.

מאמר זה מפרט את הגישה מקורית יזום כדי להשיגמדידה של פרמטרים מקומיים מכאניים באתר, מבלי להפריע את biofilm ומאפשר ציור של הפריסה המרחבית של תכונות חומר microscale ולאחר מכן ההטרוגניות מכאנית. העיקרון של הניסוי נשען על הסימום של biofilm גדל עם microparticles המגנטי ואחרי הטעינה מרחוק שלהם באמצעות פינצטה מגנטית בbiofilm הבוגר. עקירת חלקיקים תחת יישום כוח מגנטי מבוקר צילם מתחת למיקרוסקופ מאפשרת גזירת פרמטר viscoelastic מקומית, כל חלקיק דיווח הסביבה המקומית משלה. מתוך נתונים אלה, הפרופיל המכני 3D של biofilm ניתן להסיק, חושף dependences מצב מרחבית וסביבתי. כל הניסוי תוכלו לראות כאן על E. biofilm coli שנעשה על ידי זן מהונדס גנטי נושא פלסמיד כמו F-derepressed. התוצאות מפורטות במאמר האחרון ¹⁸ מספקות חזון ייחודי של הפנים של מכניקת biofilm ללא פגע.

Protocol

1. חיידקי תרבות והכנת השעיה פיק מושבה גדלה טרי מצלחת אגר Lysogeny מרק (LB), לחסן אותו ב 5 מיליליטר מדיום LB נוזלי המכיל 100 גר '/ מיליליטר אמפיצילין μ ו7.5 גר' / מיליליטר טטרציקלין μ ודגירה אותו במשך 5 עד 6 שעות ב 37 ° C ב ר…

Representative Results

ניתוח טיפוסי יספק את הפריסה המרחבית של הפרמטרים viscoelastic בקנה מידת מיקרון בbiofilm חיים מבלי להפריע להסדר המקורי שלה. תוצאות אופייניות מוצגות באיור 7 שבו הערכים של 0 J – ציות האלסטיות – מקבלים כפונקציה של Z-הציר לאורך העומק ושל ציר ה-Y לאורך ממד רוחב של biofilm. כל נ…

Discussion

חלקיקים מגנטיים זה זריעה ומושכים ניסוי אפשר במיפוי 3D באתרו של הפרמטרים viscoelastic של biofilm גובר במצבו המקורי. גישה זו חשפה את ההטרוגניות מכאנית של א ' biofilm coli גדל כאן ונתן רמזים להצביע על רכיבי biofilm תמיכה בתכונות פיזיות biofilm, חזק המצביעים על משמעות בסיס?…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin