Induction du envahissantes Transitional cancer de la vessie cellulaire dans immunitaire humain MUC1 souris transgéniques intactes: un modèle pour le développement d'immunothérapie
Summary
Une N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine induite modèle de cancer de la vessie a été développé en mucine humaine 1 (MUC1) de souris transgéniques à des fins de test MUC1-dirigé l'immunothérapie. Après l'administration d'un vaccin peptidique MUC1 ciblée, une réponse des lymphocytes T cytotoxiques pour MUC1 a été confirmée par la mesure des niveaux de cytokines plasmatiques et de l'activité cellulaire T spécifique.
Abstract
Un modèle préclinique de cancer invasif de la vessie a été développé en mucine humaine 1 (MUC1) (MUC1.Tg) de souris transgéniques à des fins d'évaluation de l'immunothérapie et / ou la chimiothérapie cytotoxique. Pour induire un cancer de la vessie, C57BL / 6 (type MUC1.Tg et sauvages) ont été traités par voie orale avec l'agent cancérigène N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) à 3,0 mg / jour, 5 jours / semaine pendant 12 semaines. Pour évaluer les effets de OH-BBN sur le profil des cytokines sériques au cours du développement tumoral, le sang total ont été recueillis par des saignements sous-maxillaires avant le traitement et toutes les quatre semaines. En outre, un vaccin contre le peptide MUC1 ciblée et un placebo ont été administrés à des groupes de souris par semaine pendant huit semaines. Multiplex fluorimétriques immunoanalyses de microbilles de cytokines sériques au cours du développement tumoral et après la vaccination ont été réalisées. A la fin, l'interféron gamma (IFN-γ) / interleukine-4 analyse (IL-4) ELISpot pour MUC1 réponse immunitaire des cellules T spécifiques et des évaluations histopathologiques de type de tumeuret la qualité ont été réalisées. Les résultats montrent que: (1) l'incidence du cancer de la vessie chez les souris de type sauvage et les deux MUC1.Tg était de 67%, (2) les carcinomes à cellules transitionnelles (TCC) développés à un ratio de 2:1 par rapport aux carcinomes spinocellulaires (CSC) , (3) des cytokines inflammatoires augmenté avec le temps au cours du développement tumoral, et (4) l'administration du vaccin peptide induit un profil de cytokines Th1 sérum-polarisé et une réponse des cellules T spécifiques MUC1. Tous les tumeurs chez les souris MUC1.Tg étaient positifs pour MUC1 expression, et la moitié des tumeurs chez les souris de type sauvage ont été MUC1.Tg et invasive. En conclusion, en utilisant une approche d'équipe à travers la coordination des efforts des pharmacologues, des immunologistes, des pathologistes et biologistes moléculaires, nous avons développé un modèle de souris transgénique intact immunitaire du cancer de la vessie qui exprime hMUC1.
Introduction
cancer de la vessie est le quatrième forme la plus commune de cancer et la huitième cause de décès par cancer chez les hommes américains. Aux États-Unis, on estime que 72.500 nouveaux cas et 15.000 décès par cancer de la vessie sont attendus entre hommes et femmes confondus en 2013 1. L'incidence du cancer de la vessie est environ trois fois plus élevé chez les hommes que chez les femmes. Aux États-Unis, les carcinomes à cellules transitionnelles (TCC) représentent plus de 90% des cas, tandis que les carcinomes spinocellulaires (CSC) ont une incidence de moins de 2% 2. Le taux de survie à 5 ans par rapport global pour papillaire TCC est de 91,5% contre seulement 30,9% pour les CSC 2. Bien que les TCC papillaires non invasives représentent environ 75% des cas au moment du diagnostic, même avec un traitement de plus de 50% des patients connaîtront une récidive dans les 5 ans, avec un maximum de 30% de ces patients évoluant vers muscle maladie invasive 3,4 . Schémas thérapeutiques classiques pour non-musculaire invasive maladie comprennent la résection transurétrale (TUR) suivie d'une chimiothérapie intravésicale. Chez les patients atteints Ta haute qualité ou des tumeurs T1, une TUR de répétition peut être effectuée avant la chimiothérapie 3,4. Pour ces patients présentant des récidives de Ta bas grade ou TA de haute qualité ou des lésions T1, TUR suivie d'une chimiothérapie adjuvante ou immunothérapie sous la forme de bacille de Calmette-Guérin (BCG) peut être utilisé 3,4. Intravésicale BCG a été montré supérieur à intravésicale mitomycine C par rapport au temps de récurrence 5. Pour la maladie invasive du muscle T2, cystectomie radicale avec ou sans chimiothérapie néoadjuvante est le traitement recommandé 3. Chez les patients avec SCC, cystectomie radicale semble être le traitement le plus efficace 6. Étant donné les taux très élevés de récidive malgré les meilleurs traitements disponibles, il ya clairement un besoin de nouvelles thérapies plus efficaces contre le cancer de la vessie.
L'expansion de nouvelles immunothérapies pour bladdcancer ER est une approche possible qui pourrait s'annoncer prometteuse pour prolonger la survie sans maladie. Historiquement, le BCG a été le seul immunothérapie efficace contre le cancer de la vessie. Son mécanisme d'action est pensé pour impliquer l'induction non spécifique d'une réponse immunitaire de type T-helper 1 (Th1) via des niveaux croissants de l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron gamma (IFN-γ) 4. Cellulaire, ou Th1 immunité, est essentiel dans l'immunothérapie du cancer comme humorale, ou Th2, l'immunité n'a jamais été montré pour être efficace contre les tumeurs solides, à l'exception des anticorps dirigés contre les récepteurs du facteur de croissance 7. Dans une tentative pour améliorer les avantages de BCG monothérapie IFN-α 2B/BCG immunothérapie combinaison a été évaluée dans un essai clinique de phase II avec des résultats peu concluants 8. Une autre approche pour l'immunothérapie du cancer de la vessie peut être de cibler des antigènes associés aux tumeurs (TAA), l'identification de ce qui a rendu l'immunothérapie du cancer plus précis 7 </splace>.
Un tel TAA est une mucine (MUC1), qui est une glycoprotéine de surface de cellule surexprimé dans de nombreux cancers des cellules épithéliales, comme la vessie, du sein, du poumon et le cancer du pancréas 9,10. L'expression et la modification de MUC1 est également substantiellement modifiées au cours de la carcinogenèse, de telle sorte que underglycosylation expose des séquences d'acides aminés antigéniques des dits nombre variable de répétitions en tandem (VNTR) sur la base des peptides. Alors que MUC1 est un auto-molécule, ces régions VNTR immunodominantes ne sont normalement pas exposés en raison des importants glycosylation, et donc ils sont vus par le système immunitaire 11,12 étranger. Lymphocytes T cytotoxiques (CTL) qui reconnaissent spécifiquement MUC1 épitopes ont été isolés à partir de la tumeur ganglions lymphatiques de drainage des patients atteints de cancer du sein 13, ainsi que le sang et la moelle osseuse des patients atteints de myélome 14,15, ce qui MUC1 une cible potentielle pour une réponse immunitaire cellulaire. Les VNTRs immunodominantes du underglycosylateforme d de MUC1 sont reconnus par les CTL, ce qui entraîne la destruction des cellules tumorales 16-19. Réponses immunitaires cellulaires et / ou humorale autochtones à MUC1 cancéreuses sont, cependant, pas assez forte pour éliminer les tumeurs. Pour augmenter la réponse immunitaire est affaibli déjà existant pour MUC1, peptides immuno-synthétiques peuvent être introduits par la vaccination pour générer une réponse CTL assez fort pour être d'avantage clinique 18,20. Un vaccin liposomale MUC1 a déjà été montré pour augmenter la survie des patients atteints de cancer du poumon 21,22, générer des CTL capables de tuer les cellules tumorales MUC1-positifs, et produire une réponse de cytokines Th1 polarisé 23,24. Avec un haut niveau d'expression de MUC1 9,11,25, le cancer de la vessie est un candidat logique pour tester MUC1 dirigée immunothérapie 26,27. En outre, MUC1 a un potentiel comme facteur pronostique dans cancer de la vessie 28, expression de MUC1 dans TCC est significativement associée avec le stade et le grade, et métastatique TCCa été montré pour continuer à exprimer MUC1 29.
Afin d'évaluer l'utilité potentielle de l'immunothérapie dirigée MUC1 dans le cancer de la vessie, nous avons développé un MUC1 humaine intacte immunitaire (hMUC1) exprimant transgénique (MUC1.Tg) modèle murin de congénique cancer de la vessie sur le fond C57BL / 6 30. MUC1 humain est exprimé comme une protéine du soi sous le contrôle de son propre promoteur, résultant en un profil d'expression tissulaire conforme à celle observée chez l'homme 30,31. Les souris ont été induites par le carcinogène de la vessie appelée N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) 32, puis les tumeurs résultant ont été évalués pour hMUC1 expression et le type de tumeur et de qualité. Pour évaluer l'effet de la substance cancérigène sur Th1/Th2 niveaux de cytokines au cours du développement tumoral, des échantillons de sérum ont été prélevés périodiquement pour l'analyse multiplex. Les souris ont ensuite été traités avec un vaccin peptidique MUC1 ciblée, et la cytokine sérum et les réponses immunitaires étaient d'évaluationted par multiplex fluorimétrique immuno-microbille et ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'induction réussie invasive cancer de la vessie à cellules transitionnelles et squameuses chez les souris MUC1.Tg humaines propose un modèle préclinique pour le développement de l'immunothérapie. Études d'immunothérapie nécessitent l'utilisation d'un modèle intact spontanée, à l'abri afin d'évaluer la réponse inflammatoire à la progression tumorale au fil du temps ainsi que la réponse immunitaire à l'immunothérapie. Dans un modèle de développement de tumeurs spontané…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Programme de biologie Davis souris UC pour la reproduction des souris. Cette recherche a été financée par une subvention de Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
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