La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia
Summary
Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.
Abstract
Un modelo preclínico de cáncer de vejiga invasivo fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) transgénicos (MUC1.Tg) ratones para el propósito de la evaluación de la inmunoterapia y / o quimioterapia citotóxica. Para inducir el cáncer de vejiga, C57BL / 6 ratones (tipo MUC1.Tg y silvestres) fueron tratados por vía oral con el carcinógeno N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / día, 5 días / semana durante 12 semanas. Para evaluar los efectos de OH-BBN en el perfil de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor, sangre total se recogió a través de hemorragias submandibulares antes del tratamiento y cada cuatro semanas. Además, una vacuna de péptido MUC1-específica y el placebo se administraron a grupos de ratones a la semana durante ocho semanas. Se realizaron Multiplex fluorométricos inmunoanálisis microperlas de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor y después de la vacunación. A la terminación, el interferón gamma (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análisis de ELISPOT para MUC1 respuesta inmune de células T específica y evaluaciones histopatológicas de tipo de tumory se realizaron grado. Los resultados mostraron que: (1) la incidencia de cáncer de vejiga en ratones de tipo salvaje tanto MUC1.Tg y fue de 67%; (2) carcinomas de células transicionales (TCC) desarrollados en la relación 2:1 en comparación con carcinomas de células escamosas (SCC) ; (3) las citoquinas inflamatorias se incrementaron con el tiempo durante el desarrollo del tumor, y (4) la administración de la vacuna de péptido induce un perfil de citoquinas Th1-polarizado suero y una respuesta de células T específica MUC1. Todos los tumores en ratones MUC1.Tg fueron positivos para la expresión de MUC1, y la mitad de todos los tumores en ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg eran invasiva. En conclusión, el uso de un enfoque de equipo a través de la coordinación de los esfuerzos de los farmacólogos, inmunólogos, anatomopatólogos y biólogos moleculares, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico intacto inmunológico del cáncer de vejiga que expresa hMUC1.
Introduction
El cáncer de vejiga es el cuarto tipo de cáncer más común y la octava causa de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses. En los Estados Unidos, se espera que unos 72.500 nuevos casos y 15.000 muertes por cáncer de vejiga entre los hombres y mujeres en conjunto en 2013 1. La incidencia de cáncer de vejiga es aproximadamente tres veces mayor en los hombres que en las mujeres. En los Estados Unidos, carcinomas de células transicionales (TCC) representan más del 90% de los casos, mientras que los carcinomas de células escamosas (SCC) tienen una incidencia de menos de 2% 2. La tasa de supervivencia a 5 años relativa global para papilar TCC es 91,5% frente a sólo el 30,9% de SCC 2. Aunque los TCC papilares no invasivos representan aproximadamente el 75% de los casos en el momento del diagnóstico, incluso con el tratamiento de más de 50% de los pacientes experimentará una recurrencia dentro de 5 años, con un máximo de 30% de estos pacientes progresa a la enfermedad invasiva del músculo 3,4 . Pautas de tratamiento habituales para inv no músculoenfermedad ASIVE incluye la resección transuretral (TUR) seguida de quimioterapia intravesical. En pacientes con Ta de alto grado o tumores T1, una repetición TUR se puede realizar antes de la quimioterapia 3,4. Para aquellos pacientes con recurrencias Ta de bajo grado o Ta de alto grado o lesiones T1, RTU seguida de quimioterapia o inmunoterapia adyuvante en la forma de bacilo de Calmette-Guerin (BCG) se puede usar 3,4. Intravesical de BCG se ha demostrado ser superior a la mitomicina C intravesical con respecto al tiempo hasta la recurrencia 5. Para la enfermedad invasiva del músculo T2, la cistectomía radical con o sin quimioterapia neoadyuvante es el tratamiento recomendado 3. En los pacientes con SCC, la cistectomía radical parece ser el tratamiento más efectivo 6. Dadas las altas tasas de recurrencia a pesar de los tratamientos disponibles, existe una clara necesidad de nuevas terapias más eficaces para el cáncer de vejiga.
Ampliar nuevas inmunoterapias para Bladdcáncer er es un posible enfoque que puede mantener la promesa para prolongar la supervivencia libre de enfermedad. Históricamente, BCG ha sido la única inmunoterapia eficaz para el cáncer de vejiga. Se cree que su mecanismo de acción para involucrar a la inducción no específica de una respuesta inmunitaria de tipo T helper 1 (Th1) a través de aumento de los niveles de interleucina-2 (IL-2) y el interferón gamma (IFN-γ) 4. Celular, o la inmunidad Th1, es crítico en la inmunoterapia del cáncer como humoral, o Th2, inmunidad nunca se ha demostrado ser eficaz contra los tumores sólidos, con la excepción de anticuerpos dirigidos contra los receptores del factor de crecimiento 7. En un intento de mejorar los beneficios de BCG monoterapia, IFN-α combinación 2B/BCG inmunoterapia se evaluó en un ensayo clínico de fase II con resultados no concluyentes 8. Una aproximación alternativa a la inmunoterapia para el cáncer de vejiga puede ser para dirigir antígenos asociados a tumores (TAA), la identificación de lo que ha hecho la inmunoterapia del cáncer más específica 7 </sa>.
Uno de estos TAA es mucina 1 (MUC1), que es una glicoproteína de superficie celular sobreexpresados en muchos cánceres de células epiteliales, tales como la vejiga, de mama, de pulmón, y cáncer de páncreas 9,10. La expresión y la modificación de MUC1 también se altera sustancialmente durante la carcinogénesis, de tal manera que underglycosylation expone secuencias antigénicas de aminoácidos conocidos como número variable de repeticiones en tándem (VNTR) en el núcleo peptídico. Mientras MUC1 es una auto-molécula, estas regiones VNTR inmunodominantes no están normalmente expuestos debido a la amplia glicosilación, y por lo tanto son vistos por el sistema inmune como 11,12 extranjera. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen específicamente epítopos de MUC1 se han aislado de los ganglios linfáticos que drenan el tumor de los pacientes de cáncer de mama 13, así como la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma 14,15, haciendo MUC1 un blanco potencial para un respuesta inmune celular. Los VNTR inmunodominantes de la underglycosylated forma de MUC1 son reconocidos por CTL, lo que resulta en la destrucción de las células tumorales 16-19. La respuesta inmune celular y / o humoral nativos a MUC1 cancerosos son, sin embargo, no lo suficientemente fuerte como para eliminar los tumores. Para aumentar la respuesta inmune débil ya existente para MUC1, péptidos inmunodominantes sintéticos se pueden introducir a través de la vacunación para generar una respuesta de CTL lo suficientemente fuerte para ser de beneficio clínico 18,20. Una vacuna liposomal MUC1 ya se ha demostrado que aumenta la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón 21,22, generar CTL capaces de matar las células tumorales positivas para MUC1, y producir una respuesta de citoquinas Th1-polarizado 23,24. Con un alto nivel de expresión de MUC1 9,11,25, cáncer de vejiga es un candidato lógico para probar MUC1-inmunoterapia dirigida 26,27. Además, MUC1 tiene potencial como factor pronóstico en el cáncer de vejiga 28, MUC1 expresión en TCC se asoció significativamente con el estadio y grado, y metastásicos TCCse ha demostrado que continuar expresando MUC1 29.
Con el fin de evaluar la utilidad potencial de la inmunoterapia MUC1-dirigida en el cáncer de vejiga, hemos desarrollado un MUC1 humano intacto inmune (hMUC1)-expresando transgénico (MUC1.Tg) modelo de ratón de congenic cáncer de vejiga en los C57BL / 6 de fondo 30. MUC1 humana se expresa como un auto-proteínas bajo el control de su propio promotor, que resulta en un patrón de expresión de tejido consistente con la observada en los seres humanos 30,31. Los ratones se indujeron con el conocido carcinógeno vejiga N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) 32, y a continuación, se evaluaron los tumores resultantes para hMUC1 expresión y el tipo y grado del tumor. Para evaluar el efecto de la sustancia cancerígena en los niveles de citoquinas Th1/Th2 durante el desarrollo de tumores, se recogieron muestras de suero periódicamente para el análisis múltiplex. Los ratones fueron tratados con una vacuna de péptido MUC1-específica, y la citoquina en suero y respuestas inmunes eran evaluaciónted por múltiplex inmunoensayo fluorimétrico microbead y ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inducción exitosa de carcinoma de células transicionales de vejiga y de células escamosas invasivo en ratones MUC1.Tg humanos ofrece un modelo preclínico para el desarrollo de la inmunoterapia. Estudios inmunoterapéuticas requieren el uso de un modelo intacta espontánea, inmunológico con el fin de evaluar la respuesta inflamatoria a la progresión del tumor con el tiempo, así como la respuesta inmune a la inmunoterapia. En un modelo desarrollo de tumores espontáneo, el microambiente tumoral se mantiene intac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Programa de Biología de la Universidad de California Davis ratón para la cría de los ratones. Esta investigación fue apoyada por una donación de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
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