Индукция инвазивная карцинома Переходные мочевого пузыря в иммунных интактными человеческими MUC1 трансгенных мышах: модель для иммунотерапии развития
Summary
N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов модели индуцированного рака мочевого пузыря был разработан в человеческих муцина 1 (MUC1) трансгенных мышей с целью тестирования MUC1-направленной иммунотерапии. После введения MUC1-целевой пептид вакцина, цитотоксических Т-лимфоцитов ответ на MUC1 была подтверждена путем измерения сывороточного уровня цитокинов и Т-клеток специфической активности.
Abstract
Доклинических моделей инвазивного рака мочевого пузыря был разработан в человеческих муцина 1 (MUC1) трансгенных (MUC1.Tg) мышам с целью оценки иммунотерапии и / или цитотоксической химиотерапии. Чтобы вызвать рак мочевого пузыря, мышей C57BL / 6 (MUC1.Tg и дикий тип) перорально вводили канцероген N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов (OH-BBN) при 3,0 мг / сут, 5 сут / неделю в течение 12 недель. Чтобы оценить влияние OH-BBN на цитокиновый профиль сыворотки во время развития опухоли, цельная кровь собирали подчелюстной кровоточит до начала лечения и каждые четыре недели. Кроме того, MUC1-целевых вакцины пептида и плацебо вводили группам мышей в неделю в течение восьми недель. Мультиплекс флуорометрическая immunoanalyses микрошарика сывороточных цитокинов во время развития опухоли и после вакцинации проводились. При прекращении, гамма-интерферона (IFN-γ) / интерлейкина-4 (IL-4) ELISpot анализ MUC1 специфичных Т-клеточный иммунный ответ и гистопатологические оценки типа опухолии класс были выполнены. Результаты показали, что: (1) рака мочевого пузыря в обоих MUC1.Tg и мышей дикого типа составил 67%, (2) переходно-клеточных карцином (TCC), разработанная в соотношении 2:1 по сравнению с плоскоклеточного рака (SCC) , (3) воспалительные цитокины возрастает со временем, во время развития опухоли, а также (4) введение пептида вакцина вызывает Th1-поляризованного профиль сыворотки цитокинов и MUC1 специфический Т-клеточный ответ. Все опухоли в MUC1.Tg мышей были положительными на MUC1 выражения, и половина всех опухолей у MUC1.Tg и мышей дикого типа были инвазивными. В заключение, используя командный подход на основе координации усилий фармакологов, иммунологов, патологоанатомов и молекулярных биологов, мы разработали иммунной нетронутыми трансгенных мышах рака мочевого пузыря, который выражает hMUC1.
Introduction
Рак мочевого пузыря является четвертым наиболее распространенной формой рака и восьмой ведущей причиной смерти от рака среди американских мужчин. В Соединенных Штатах, по оценкам, 72 500 новых случаев заболевания и 15 000 смертей от рака мочевого пузыря, как ожидается, среди мужчин и женщин в 2013 году в сочетании 1. Рака мочевого пузыря примерно в три раза выше у мужчин, чем у женщин. В Соединенных Штатах, переходно-клеточных карцином (TCC) приходится более 90% случаев, в то время как плоскоклеточный рак (SCC) имеют частоту менее 2% 2. Общий относительный 5-летняя выживаемость для папиллярного TCC является 91,5% по сравнению с 30,9% только для SCC 2. Хотя неинвазивный папиллярный страны, предоставляющие войска составляют приблизительно 75% случаев на момент постановки диагноза, даже при лечении более чем 50% пациентов наблюдается рецидив в течение 5 лет, при этом до 30% этих больных прогрессирующей мышечной инвазивных заболеваний 3,4 . Типичные схемы лечения немышечные инвasive болезни включают трансуретральной резекции (ТУР) с последующей внутрипузырной химиотерапии. У пациентов с полноценным Та или T1 опухолей, повторите TUR может быть выполнено до химиотерапии 3,4. Для тех пациентов с низкой степени Ta рецидивов или высококачественный Та или T1 поражений, ТУР последующей адъювантной химиотерапии или иммунотерапии в виде бацилла Кальметта-Герена (BCG), можно использовать 3,4. Внутрипузырной БЦЖ было показано, что превосходит внутрипузырного C митомицин по времени для повторения 5. Для T2 мышц инвазивных заболеваний, радикальной цистэктомии с или без неоадъювантной химиотерапии является рекомендуемым Курс лечения 3. У пациентов с SCC, радикальной цистэктомии, как представляется, наиболее эффективным методом лечения 6. Учитывая очень высокий уровень рецидива, несмотря на все процедуры доступны, существует явная необходимость в новых, более эффективных методов лечения рака мочевого пузыря.
Расширение новых иммунотерапии для bladdER железы является одним из возможных подходов, что может перспективны для расширения выживаемость без признаков заболевания. Исторически сложилось так, BCG была единственным эффективным для иммунотерапии рака мочевого пузыря. Механизм его действия как полагают, включает неспецифический индукции Т-хелперов 1 (Th1) тип иммунного ответа за счет увеличения уровней интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (IFN-γ) 4. Cellular, или Th1 иммунитет, имеет решающее значение в иммунотерапии рака, как гуморальный, или Th2, иммунитет никогда не была показана эффективность против солидных опухолей, за исключением антител, направленных против рецепторов факторов роста 7. В попытке улучшить преимущества монотерапии BCG, IFN-α 2B/BCG комбинации иммунотерапии оценивали в фазе II клинического испытания с неоднозначные результаты 8. Альтернативный подход к иммунотерапии рака мочевого пузыря может быть ориентация ассоциированные с опухолью антигены (ТАА), идентификация, которая сделала иммунотерапии рака более конкретными 7 </sвверх>.
Одним из таких является ТАА муцина 1 (MUC1), которая представляет собой гликопротеин клеточной поверхности избыточно экспрессируется во многих эпителиальные клетки рака, такие как пузыря, молочной железы, легких и рака поджелудочной железы 9,10. Выражение и модификации MUC1 также существенно изменены при канцерогенезе, так что underglycosylation предоставляет антигенных последовательностей аминокислот, известных как переменное число тандемных повторов (VNTR) в центральной пептидной. В то время как MUC1 является самостоятельной молекулы, эти регионы иммунодоминантные VNTR обычно не воздействует из-за обширных гликозилирования, и таким образом они видны со стороны иммунной системы, как иностранные 11,12. Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), которые специфически распознают эпитопы MUC1 были выделены из опухолей лимфатических узлах больных раком молочной железы 13, а также в крови и костном мозге больных миеломой 14,15, что делает MUC1 потенциальной мишенью клеточный иммунный ответ. Иммунодоминантные VNTRs из underglycosylateD формы MUC1 признаны ЦТЛ, в результате разрушения опухолевых клеток 16-19. Родные клеточного и / или гуморального иммунного ответа к раковым MUC1, однако, не достаточно сильны, чтобы удалить опухоль. Для увеличения уже существующих слабый иммунный ответ на MUC1, синтетические иммунодоминантном пептиды могут быть введены путем вакцинации, чтобы генерировать ЦТЛ-ответ достаточно сильным, чтобы быть клинической пользы 18,20. MUC1 липосомальной вакцины уже было показано увеличение выживаемости у больных раком легкого 21,22, генерировать ЦТЛ способны убить MUC1-позитивные клетки опухоли, и производят Th1-цитокинов поляризованные ответ 23,24. При высоком уровне MUC1 выражение 9,11,25, рак мочевого пузыря является логическим кандидатом для тестирования MUC1-направленной иммунотерапии 26,27. Кроме того, MUC1 имеет потенциал в качестве прогностического фактора при раке мочевого пузыря 28, MUC1 TCC выражение в значительной степени связано с стадии и степени, и метастатических TCCБыло показано, что по-прежнему выражают MUC1 29.
Для того чтобы оценить потенциальную полезность MUC1-направленной иммунотерапии при раке мочевого пузыря, мы разработали нетронутыми человеческой иммунной MUC1 (hMUC1) экспрессирующих трансгенных (MUC1.Tg) мышиной модели рака мочевого пузыря конгенные на C57BL / 6 фоне 30. MUC1 человека выражается в виде собственного белка под контролем своего собственного промотора, в результате чего образец ткани выражение согласуется с наблюдаемым у людей 30,31. Мыши были индуцированы с известным канцерогеном мочевой пузырь N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов (OH-BBN) 32, а затем полученный опухолей оценивали по hMUC1 экспрессии и типа опухоли и класс. Для оценки влияния канцерогенов на Th1/Th2 уровни цитокинов в процессе развития опухоли, сыворотку собирали образцы периодически для мультиплексного анализа. Мышей обрабатывали MUC1-целевой пептид вакцины и сыворотки цитокинов и иммунных реакций были оценТед по мультиплекса флуорометрическая иммунологического микрошарика и ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешное индукции инвазивных переходных и плоскоклеточный рак мочевого пузыря у человека мышей MUC1.Tg предлагает доклинической модели иммунотерапии развития. Immunotherapeutic исследований требуют использования спонтанное, иммунных нетронутыми модель для оценки воспалительного ответа на пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить UC Davis Мышь биологии Программа для разведения мышей. Это исследование было поддержано грантом Merck KGaA, Дармштадт, Германия.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
