Inductie van Invasieve Transitional Cell blaascarcinoom in Immune Intact Human MUC1 transgene muizen: Een model voor Immunotherapie Ontwikkeling
Summary
Een N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine-geïnduceerde blaaskanker model werd ontwikkeld in humane mucine 1 (MUC1) transgene muizen voor de beproeving van de MUC1-gerichte immunotherapie. Na toediening van een MUC1-gericht peptide vaccin was een cytotoxische T-lymfocyt respons tegen MUC1 bevestigd door metingen van serum cytokinen en T-cel-specifieke activiteit.
Abstract
Een preklinisch model van invasieve blaaskanker werd in humane mucine 1 (MUC1) transgene (MUC1.Tg) muizen voor de evaluatie immunotherapie en / of cytotoxische chemotherapie. Blaaskanker, C57BL / 6 muizen (MUC1.Tg en wild type) werden oraal behandeld met de kankerverwekkende N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) en 3,0 mg / dag, 5 dagen / week induceren gedurende 12 weken. Om de effecten van OH-BBN op serum cytokine profiel gedurende tumorontwikkeling te beoordelen, werd volbloed verzameld via submandibulaire bloedt voorafgaand aan de behandeling en om de vier weken. Daarnaast werden een MUC1-gericht peptide vaccin en placebo toegediend aan groepen muizen per week gedurende acht weken. Multiplex fluorometrische microbeads immunoanalyses van serumcytokinen gedurende tumorontwikkeling en na vaccinatie werden uitgevoerd. Bij beëindiging interferon gamma (IFN-γ) / interleukine-4 (IL-4) ELISPOT-analyse voor MUC1 specifieke T-cel-immuunrespons en histopathologische evaluatie van tumortypeen rang werden uitgevoerd. De resultaten toonden aan dat: (1) de incidentie van blaaskanker zowel MUC1.Tg en wild type muizen was 67%, (2) overgangsepitheelcarcinoom carcinomen (TCC) ontwikkeld in een 2:1 verhouding vergeleken met plaveiselcelcarcinoom (SCC) , (3) inflammatoire cytokines toe met de tijd gedurende tumorontwikkeling en (4) de toediening van het peptide vaccin induceert een Th1-gepolariseerde serum cytokine profiel en een MUC1 specifieke T-cel respons. Alle tumoren in MUC1.Tg muizen waren positief voor MUC1 expressie, en de helft van alle tumoren in MUC1.Tg en wild-type muizen waren invasief. Tot slot, met behulp van een team aanpak door de coördinatie van de inspanningen van farmacologen, immunologen, pathologen en moleculair biologen, we hebben een immuunsysteem intact transgeen muismodel van blaaskanker die hMUC1 uitdrukt ontwikkeld.
Introduction
Blaaskanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de achtste belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker in de Amerikaanse mannen. In de Verenigde Staten zijn naar schatting 72.500 nieuwe gevallen en 15.000 sterfgevallen als gevolg van blaaskanker verwacht onder mannen en vrouwen gecombineerd in 2013 1. De incidentie van blaaskanker ongeveer drie keer zo hoog bij mannen dan bij vrouwen. In de Verenigde Staten, overgangs-cell carcinoma (TCC) zijn goed voor meer dan 90% van de gevallen, terwijl plaveiselcelcarcinomen (SCC) hebben een incidentie van minder dan 2% 2. De totale relatieve 5-jaarsoverleving voor papillaire TCC is 91,5% tegenover slechts 30,9% voor SCC 2. Hoewel invasieve papillaire TCC zijn op ongeveer 75% van de gevallen bij de diagnose, waarbij behandeling meer dan 50% van de patiënten een recidief ervaren binnen 5 jaar, met tot 30% van deze patiënten die progressie om spier invasieve ziekte 3,4 . Typische behandelingen voor niet-spier invasive ziekte zijn transurethrale resectie (TUR), gevolgd door intravesicale chemotherapie. Bij patiënten met hoogwaardige Ta of T1 tumoren, kan een herhaling TUR worden uitgevoerd vóór chemotherapie 3,4. Voor die patiënten met laaggradige Ta recidieven of high-grade Ta of T1 laesies, TUR gevolgd door adjuvante chemotherapie of immunotherapie in de vorm van Bacillus Calmette-Guerin (BCG) worden gebruikt 3,4. Intravesicale BCG is gebleken superieur te zijn intravesicale mitomycine C met betrekking tot tijd tot recidief 5. Voor T2 spier-invasieve ziekte, radicale cystectomie met of zonder neoadjuvante chemotherapie is de aanbevolen loop van de behandeling 3. Bij patiënten met SCC, lijkt radicale cystectomie de meest effectieve behandeling 6 zijn. Gezien de zeer hoge herhaling ondanks de beschikbare behandelingen, is er duidelijk een behoefte aan nieuwe, meer efficiënte therapie voor blaaskanker.
Uitbreiden van nieuwe immuuntherapie voor Bladder kanker is een mogelijke aanpak die belofte kan houden voor de uitbreiding van de ziektevrije overleving. Historisch gezien, is BCG is de enige effectieve immuuntherapie bij blaaskanker. Het werkingsmechanisme wordt verondersteld om de niet-specifieke inductie van een T-helper 1 (Th1) Type immuunrespons door toenemende niveaus van interleukine-2 (IL-2) en interferon gamma (IFN-γ) 4 omvatten. Cellulaire of Th1 immuniteit is essentieel bij kanker immunotherapie humorale of Th2 is immuniteit nooit aangetoond effectief tegen vaste tumoren zijn, met uitzondering van antilichamen tegen groeifactorreceptoren 7. In een poging om te verbeteren op de voordelen van BCG monotherapie werd IFN-α 2B/BCG combinatie immunotherapie geëvalueerd in een fase II klinische studie met povere resultaten 8. Een alternatieve benadering van immunotherapie voor blaaskanker kan zijn tumor-geassocieerde antigenen (TAA), de identificatie waarvan kankerimmunotherapie specifieker 7 gemaakt targeten </sup>.
Een dergelijke TAA 1 mucine (MUC1), een celoppervlak glycoproteïne tot overexpressie gebracht in vele epitheliale kanker zoals blaas-, borst-, long-en pancreaskanker 9,10. De expressie en modificatie van MUC1 wordt ook aanzienlijk tijdens carcinogenese gewijzigd, zodat underglycosylation bloot antigene sequenties van aminozuren genoemd variabel aantal tandem herhalingen (VNTR) de peptidekern. Terwijl MUC1 is een zelf-molecuul, worden deze immunodominante regio VNTR normaal blootgesteld door uitgebreide glycosylatie en waardoor ze worden gezien door het immuunsysteem als vreemd 11,12. Cytotoxische T-lymfocyten (CTL) die specifiek epitopen herkennen MUC1 geïsoleerd uit tumor-drainerende lymfklieren van borstkankerpatiënten 13, evenals het bloed en beenmerg van myeloom 14,15, waardoor MUC1 een potentieel doelwit voor een cellulaire immuunrespons. De immunodominante VNTRs van de underglycosylated vorm van MUC1 worden herkend door CTL's, wat resulteert in de vernietiging van tumorcellen 16-19. Inheemse cellulaire en / of humorale immuunresponsen op kanker MUC1 zijn echter niet sterk genoeg om tumoren te elimineren. Aan de reeds bestaande zwakke immuunrespons tegen MUC1 vergroten, kunnen synthetische immuundominante peptiden door vaccinatie worden ingevoerd om een CTL respons sterk genoeg te zijn van klinisch voordeel 18,20 genereren. Een liposomale MUC1 vaccin is reeds aangetoond dat overleving in longkankerpatiënten 21,22 verhogen genereren CTLs kunnen doden MUC1-positieve tumorcellen, en produceren een Th1-gepolariseerde cytokine response 23,24. Met een hoge mate van MUC1 expressie 9,11,25, blaaskanker is een logische kandidaat voor het testen van MUC1-gerichte immunotherapie 26,27. Verder MUC1 heeft potentieel als voorspellende factor bij blaaskanker 28, MUC1 expressie in TCC is significant geassocieerd met stadium en graad, en metastatische TCCis aangetoond blijven drukken MUC1 29.
Om het potentiële nut van MUC1-gerichte immunotherapie bij blaaskanker evalueren we een immune intact menselijk MUC1 (hMUC1)-transgene expressie (MUC1.Tg) muismodel van blaaskanker congenic de C57BL / 6 achtergrond 30 ontwikkeld. Human MUC1 wordt uitgedrukt als een zelf-eiwit onder de controle van zijn eigen promoter, waardoor een weefsel expressie patroon verlopen waargenomen in personen 30,31. De muizen werden geïnduceerd met de bekende blaas carcinogeen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) 32, en vervolgens de resulterende tumoren werden beoordeeld op hMUC1 expressie en tumor soort en kwaliteit. Om het effect van het carcinogeen op Th1/Th2 cytokine niveaus gedurende tumorontwikkeling beoordelen, werden periodiek serummonsters verzameld voor multiplex analyse. Muizen werden vervolgens behandeld met een MUC1-gericht peptide vaccin, en serum cytokine en immuunreacties waren evaluated door multiplex fluorometrische microbead immunoassay en ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
De succesvolle inductie van invasieve overgangs-en plaveiselcelcarcinoom blaascarcinoom in menselijke MUC1.Tg muizen biedt een preklinisch model voor Immunotherapie ontwikkeling. Immunotherapeutische studies vereisen het gebruik van een spontane immune intact model om de ontstekingsreactie op tumorprogressie tijd en de immuunrespons op immunotherapie te evalueren. In een spontane tumorontwikkeling model, de tumor micro blijft intact en de tumoren in een representatieve groei waarmee de evaluatie van de antitumor effecte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de UC Davis Muis Biology Program bedanken voor het fokken van de muizen. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
