免疫無傷のヒトMUC1トランスジェニックマウスにおける侵襲移行細胞膀胱癌の誘導：免疫療法の開発のためのモデル
Summary
N-ブチル-N-（4 – ヒドロキシブチル）ニトロソアミン誘発性膀胱癌モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）テストの目的MUC1特異的免疫療法のためのトランスジェニックマウスに開発された。ターゲットMUC1ペプチドワクチンを投与した後、MUC1の細胞傷害性Tリンパ球応答は、血清サイトカインレベルおよびT細胞特異的活性を測定することにより確認した。
Abstract
浸潤性膀胱癌の前臨床モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）免疫療法および/または細胞傷害性化学療法を評価するためのトランスジェニック（MUC1.Tg）マウスにおいて開発された。膀胱癌を誘発するために、C57BL / 6マウス（MUC1.Tgおよび野生型）は、3.0 mg /日で発癌物質N-ブチル-N-（4 – ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN-OH）、5日/週で経口的に処理した12週間。腫瘍の開発中に血清サイトカインプロファイルにOH-BBNの効果を評価するために、全血を処理し、4週間ごとに先立って顎下出血を介して収集した。また、MUC1ターゲットペプチドワクチンおよびプラセボを8週間毎週マウスの群に投与した。腫瘍の発生と次の予防接種時の血清サイトカインの多重蛍光マイクロビーズimmunoanalysesを行った。終了時に、インターフェロンγ（IFN-γ）/ MUC1特異的T細胞免疫応答および腫瘍型の組織病理学的評価のためのインターロイキン-4（IL-4）のELISpot解析そして等級を行った。その結果、（1）MUC1.Tgと野生型マウスの両方における膀胱癌の発生率は67％であった。（2）2:1の比率で開発された移行上皮癌（TCC）は、扁平上皮癌（SCC）に比べ（3）炎症性サイトカインは、腫瘍の発達の間に経時的に増加し、（4）ペプチドワクチンの投与は、Th1型偏血清サイトカインプロファイルおよびMUC1特異的T細胞応答を誘導する。 MUC1.Tgマウスで全ての腫瘍はMUC1発現について陽性であった、とMUC1.Tgと野生型マウスのすべての腫瘍の半分は侵襲的であった。結論として、薬理学者、免疫学者、病理学者と分子生物学の努力の調整を通じてチームアプローチを使用して、我々はhMUC1を表現膀胱癌の免疫無傷トランスジェニックマウスモデルを開発しました。
Introduction
膀胱がんは、がんの第四の最も一般的な形式とアメリカの男性のがんによる死亡の第八の主要な原因である。米国では、膀胱癌からの推定72,500の新しい症例と15,000人が死亡、2013年1で組み合わせるの男性と女性の間で期待されている。膀胱癌の発生率は女性に比べ男性で高い約3倍である。症例の90％以上を占める米国、移行上皮癌（TCC）で、一方、扁平上皮癌（SCC）は、2％未満2の発生率を持っている。乳頭TCCの全体的な相対5年生存率はSCC 2のための唯一の30.9％に比べて91.5パーセントである。非侵襲的な乳頭のTCCも患者の50％以上の治療よりは、筋肉侵襲性疾患3,4に進行し、これらの患者の30％までで、5年以内に再発を経験すると、診断時の症例の約75％を占めていますが。 INV非筋肉の典型的な治療レジメンasive病気は膀胱内化学療法に続いて経尿道的切除術（TUR）が含まれています。高品位のTaまたはT1腫瘍を有する患者では、リピートTURは、化学療法3,4の前に行ってもよい。低悪性度のTa再発またはハイグレードのTaまたはT1病変を有する患者については、TURはカルメット-ゲランが（BCG）3,4を使用することができバチルスの形で補助化学療法や免疫療法が続く。膀胱内BCGは、再発までの時間5に対する膀胱マイトマイシンCよりも優れていることが示されている。 T2筋肉侵襲性疾患については、術前化学療法の有無にかかわらず根治的膀胱切除術は、治療3の推奨コースです。 SCC患者において、ラジカル膀胱切除は、最も効果的な治療6であると思われる。利用可能な最善の治療法にもかかわらず、再発の非常に高い率を考えると、膀胱癌のための新しい、より効果的な治療法の必要性が明らかに存在する。
bladdに対する新しい免疫療法を拡大えーがんは、無病生存期間を延長するための約束を保持することができる1つの可能なアプローチである。歴史的に、BCGは膀胱癌のための唯一の効果的な免疫療法となっています。その作用機構は増加するインターロイキン-2のレベル（IL-2）およびインターフェロンγ（IFN-γ）4を介してTヘルパー1（Th1型）型免疫応答の非特異的誘導が関与すると考えられている。携帯電話、またはTh1型免疫は、体液、またはTh2のような癌免疫療法において重要である、免疫が成長因子受容体7に対する抗体を除いて、固形腫瘍に対して有効であることが示されていない。 BCG単独療法の利点を改善する試みでは、IFN-α2B/BCGコンビネーション免疫療法は、決定的な結果は8との第II相臨床試験で評価した。膀胱癌に対する免疫療法の代替アプローチは7癌免疫療法は、より具体的な行った識別そのうち腫瘍関連抗原（のTAA）を、ターゲットにするかもしれない</s>まで。
そのようなTAAは、例えば膀胱癌、乳癌、肺癌および膵癌9,10などの多くの上皮細胞癌において過剰に発現する細胞表面糖タンパク質であるムチン-1（MUC1）である。 MUC1の発現及び変更は、実質的発癌の間に変更され、その結果underglycosylationは、ペプチドコア上のタンデムリピートの可変数（VNTR）として知られているアミノ酸の抗原配列が公開されています。 MUC1は、自己分子であるが、これらの免疫VNTR領域は、通常、広範なグリコシル化のために露出されないので、それらは外来11,12などの免疫系によって見られる。具体的にはMUC1エピトープを認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTLが）MUC1のための潜在的なターゲット作り、乳癌患者13と同様に、骨髄腫患者14,15の血液および骨髄の腫瘍流入領域リンパ節から単離されている細胞性免疫応答。 underglycosylateの免疫VNTRsMUC1のD形は、腫瘍細胞の16-19の破壊をもたらし、CTLにより認識されています。癌MUC1へのネイティブ細胞および/または体液性免疫応答は、しかし、腫瘍を除去するために十分な強さではありません。 MUC1に対する既存の弱い免疫応答を増強するために、合成ペプチドが免疫優性臨床的利益18,20からなるのに十分に強いCTL応答を生成するためにワクチン接種を介して導入することができる。 MUC1リポソームワクチンは既に、肺癌患者21,22の生存率を増加させるMUC1陽性腫瘍細胞を死滅させることができるCTLを生成し、Th1型偏サイトカイン応答23,24を生成することが示されている。 MUC1発現を9,11,25の高いレベルでは、膀胱癌は、MUC1特異的免疫療法26,27をテストするための論理的な候補である。さらに、MUC1は膀胱癌28で予後因子としての可能性を秘めている、TCCにおけるMUC1の発現が有意ステージとグレードに関連付けられており、転移性TCCMUC1 29を発現し続けることが示されている。
膀胱癌におけるMUC1特異的免疫療法の潜在的な有用性を評価するために、我々は、免疫無傷のヒトMUC1（hMUC1）を発現するC57BL / 6背景に30膀胱癌ジェニックのトランスジェニック（MUC1.Tg）マウスモデルを開発した。ヒトMUC1は、ヒト30,31において観察されるそれと一致した組織発現パターンを得、自身のプロモーターの制御下で自己タンパク質として発現される。マウスは、公知の膀胱発癌物質N-ブチル-N-（4 -ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN-OH）32で誘導した後、得られた腫瘍hMUC1発現と腫瘍の種類や悪性度を評価した。腫瘍現像時のTh1/Th2サイトカインレベルに発癌物質の効果を評価するために、血清サンプルを多重分析のために定期的に収集した。次いで、マウスをターゲットMUC1ペプチドワクチンで処理し、血清サイトカインおよび免疫応答があった評価多重蛍光マイクロビーズイムノアッセイとエリスポットによってテッド。
Protocol
Representative Results
Discussion
人間MUC1.Tgマウスの侵襲的移行と扁平上皮膀胱癌の正常な誘導は免疫療法の開発のための前臨床モデルを提供しています。免疫療法の研究では、経時的に腫瘍の進行に対する炎症応答、ならびに免疫療法に対する免疫応答を評価するために、自発的、免疫無傷のモデルの使用を必要とする。自発的な腫瘍の開発モデルにおいて、腫瘍微小環境はそのまま残り、腫瘍は治療の抗腫瘍効果の評価を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マウスを飼育するためのUCデービスマウス生物学プログラムに感謝したいと思います。この研究は、メルク、ダルムシュタット、ドイツからの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
