Induktion af Invasive Transitional Cell blærecarcinom i Immune intakt humant MUC1 transgene mus: En model for immunterapi Development
Summary
En N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin-induceret blærekræft model blev udviklet i human mucin 1 (MUC1) transgene mus med henblik på prøvning MUC1-rettet immunterapi. Efter indgivelse af et MUC1 målrettet peptidvaccine, blev en cytotoksisk T-lymfocyt respons på MUC1 bekræftet ved måling af serum cytokinniveauer og T-celle specifik aktivitet.
Abstract
En præklinisk model for invasiv blærekræft blev udviklet i human mucin 1 (MUC1) transgene (MUC1.Tg) mus med henblik på evaluering af immunterapi og / eller kemoterapi. At fremkalde blærekræft, C57BL / 6 mus (MUC1.Tg og vildtype) blev behandlet oralt med det kræftfremkaldende N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin (OH-BBN) på 3,0 mg / dag, 5 dage / uge i 12 uger. For at vurdere effekten af OH-BBN på serum-cytokinprofil under tumor udvikling blev fuldblod indsamlet via submandibulære blødninger før behandling og hver fjerde uge. Derudover blev en MUC1 målrettet peptidvaccine og placebo administreret til grupper af mus ugentligt i otte uger. Multiplex fluorometriske microbead immunoanalyses af serumcytokiner under tumor udvikling og efter vaccination blev udført. Ved forsøgets afslutning, interferon gamma (IFN-γ) / interleukin-4 (IL-4) ELISpot analyse for MUC1 specifik T-celle-immunreaktion og histopatologiske evalueringer af tumortypeog klasse blev udført. Resultaterne viste, at: (1) forekomsten af blærekræft i både MUC1.Tg og vildtypemus var 67%, (2) transitional cell carcinomer (TCC) udviklet på en 2:1 sammenlignet med pladecellecarcinomer (SCC) , (3) inflammatoriske cytokiner steg med tiden under tumor udvikling, og (4) indgivelse af peptidet Vaccinen fremkalder et Th1-polariseret serum cytokinprofil og et MUC1 specifik T-celle-respons. Alle tumorer i MUC1.Tg mus var positive for MUC1 ekspression, og halvdelen af alle tumorer i MUC1.Tg og vildtypemus var invasiv. Konklusionen er, at bruge en team tilgang gennem koordinering af indsatsen fra farmakologer, immunologer, patologer og molekylærbiologer har vi udviklet en immun intakt transgen musemodel af blærekræft, der udtrykker hMUC1.
Introduction
Blærekræft er den fjerde mest almindelige form for kræft og den ottende hyppigste årsag til kræftdødsfald i amerikanske mænd. I USA, er en anslået 72.500 nye tilfælde og 15.000 dødsfald som følge blærekræft forventes blandt mænd og kvinder samlet i 2013 1. Forekomsten af blærekræft er cirka tre gange så højt hos mænd end hos kvinder. I USA tegner transitional cell carcinomer (TCC) for over 90% af tilfældene, mens pladecellecarcinomer (SCC) har en hyppighed på mindre end 2% 2. Den generelle relative 5-års overlevelse for papillary TCC er 91,5% sammenlignet med kun 30,9% for SCC 2.. Selvom noninvasive papillary TCCs tegner sig for cirka 75% af tilfældene på tidspunktet for diagnosen, selv med behandling mere end 50% af patienterne vil opleve en gentagelse inden for 5 år, med op til 30% af disse patienter udvikler sig til muskler invasiv sygdom 3,4 . Typiske behandlingsregimer for ikke-muskel-invasive sygdom omfatter transuretral resektion (TUR) efterfulgt af intravesikal kemoterapi. Hos patienter med high-grade Ta eller T1 tumorer kan en gentagelse TUR udføres før kemoterapi 3,4. For de patienter med lav-grade Ta tilbagefald eller high-grade Ta eller T1 læsioner, efterfulgt TUR af adjuvans kemoterapi eller immunterapi i form af Bacillus Calmette-Guerin (BCG), kan anvendes 3,4. Intravesikal BCG har vist sig at være overlegen i forhold til intravesikal mitomycin C med hensyn til tiden til tilbagefald 5. For T2 muskel invasiv sygdom, er den radikale cystectomy med eller uden neoadjuverende kemoterapi den anbefalede behandlingsforløb 3.. Hos patienter med SCC, synes radikal cystektomi at være den mest effektive behandling 6.. I betragtning af de meget høje tilbagefald på trods af de bedste behandlinger til rådighed, er der et klart behov for nye og mere effektive behandlinger for blærekræft.
Udvidelse nye immunterapier til bladdis kræft er en mulig tilgang, der kan holde løftet til at udvide sygdomsfri overlevelse. Historisk har BCG været den eneste effektive immunterapi for blærekræft. Dens virkningsmekanisme menes at involvere den uspecifikke induktion af en T-hjælper 1 (Th1) typen immunrespons via stigende niveauer af interleukin-2 (IL-2) og interferon gamma (IFN-γ) 4.. Cellulære eller Th1 immunitet, er kritisk i cancer-immunterapi som humorale eller Th2, er immuniteten aldrig vist sig at være effektiv mod solide tumorer, med undtagelse af antistoffer rettet mod vækstfaktorreceptorer 7. I et forsøg på at forbedre på fordelene ved BCG monoterapi blev IFN-α 2B/BCG kombinationen immunterapi evalueret i et fase II klinisk studie med overbevisende resultater 8.. En alternativ metode til immunterapi for blærekræft kan være at målrette tumor-associerede antigener (TAA'er), identifikation af som har gjort kræft immunterapi mere specifik 7 </sup>.
En sådan TAA mucin 1 (MUC1), som er et celleoverfladeglycoprotein overudtrykt i mange epitelceller kræftformer, såsom blære, bryst, lunge, og bugspytkirtelkræft 9,10. Ekspression og modificering af MUC1 også ændres væsentligt under carcinogenese, sådan at underglycosylation udsætter antigene sekvenser af aminosyrer kendt som variabelt antal tandemgentagelser (VNTR) på peptidet kerne. Mens MUC1 er en selvstændig molekyle, er disse immundominante VNTR regioner normalt ikke udsættes på grund af omfattende glycosylering, og dermed de opfattes af immunsystemet som fremmede 11,12. Cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er), som specifikt genkender MUC1 epitoper er blevet isoleret fra de tumor-drænende lymfeknuder fra brystkræftpatienter 13, samt blod og knoglemarv af myelomatosepatienter 14,15, hvilket gør MUC1 et potentielt mål for en cellulært immunrespons. De immundominante VNTRs af underglycosylated form af MUC1 genkendes af CTL'er, hvilket resulterer i ødelæggelse af tumorceller 16-19. Native cellulære og / eller humorale immunresponser på kræft MUC1 er dog ikke stærk nok til at fjerne tumorer. At forøge den allerede eksisterende svag immunrespons til MUC1, kan syntetiske immundominante peptider indføres gennem vaccination at generere et CTL-respons stærk nok til at være af klinisk fordel 18,20. En MUC1 liposomal vaccine er allerede vist sig at øge overlevelsen i patienter med lungecancer 21,22, generere CTL'er kan dræbe MUC1-positive tumorceller, og producere en Th1-polariseret cytokin respons 23,24. Med en høj grad af MUC1 ekspression 9,11,25, er blærekræft en logisk kandidat til test MUC1-rettet immunterapi 26,27. Desuden MUC1 har potentiale som en prognostisk faktor i blærekræft 28, MUC1 ekspression i TCC er signifikant associeret med scenen og kvalitet, og metastatisk TCChar vist sig at fortsætte med at udtrykke MUC1 29..
For at vurdere den potentielle anvendelighed af MUC1-rettet immunterapi i blærekræft, udviklede vi en immun intakt humant MUC1 (hMUC1)-udtrykkende transgene (MUC1.Tg) musemodel af blærekræft congene på C57BL / 6 baggrund 30. Human MUC1 udtrykkes som en selvstændig protein under kontrol af sin egen promotor, hvilket resulterer i en vævsekspression mønster svarende observeret hos mennesker 30,31. Musene blev induceret med den kendte blære kræftfremkaldende N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin (OH-BBN) 32, og derefter de resulterende tumorer blev vurderet for hMUC1 ekspression og tumor type og kvalitet. For at vurdere effekten af kræftfremkaldende på Th1/Th2 cytokinniveauer under tumor udvikling blev serumprøver indsamlet jævnligt for multiplex analyse. Mus blev derefter behandlet med en MUC1 målrettet peptidvaccine, og serummet cytokin og immunreaktioner blev evalueindikeret med multiplex fluorometrisk microbead immunoassay og ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den vellykkede induktion af invasive overgangs-og planocellulært blærecarcinom i menneskelige MUC1.Tg mus tilbyder en præklinisk model for Immunterapi udvikling. Immunterapeutiske undersøgelser kræver brug af en spontan, immun intakt model for at vurdere den inflammatoriske respons på tumorprogression over tid samt immunresponset over for immunterapi. I en spontan tumor udvikling model forbliver tumormikromiljøet intakt og tumorer udvikler sig en mere repræsentativ vækstrate, der giver mulighed for vurdering af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke UC Davis Mouse Biologi Program til avl af mus. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
