इम्यून बरकरार मानव MUC1 ट्रांसजेनिक चूहों में आक्रामक संक्रमणकालीन सेल मूत्राशय कार्सिनोमा की प्रेरण: Immunotherapy विकास के लिए एक मॉडल
Summary
एक N-butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine प्रेरित मूत्राशय कैंसर मॉडल मानव mucin 1 (MUC1) के परीक्षण का उद्देश्य MUC1 का निर्देश immunotherapy के लिए ट्रांसजेनिक चूहों में विकसित किया गया था. एक MUC1 लक्षित पेप्टाइड वैक्सीन के प्रशासन के बाद, MUC1 को एक साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया सीरम cytokine स्तर और टी सेल विशिष्ट गतिविधि को मापने के द्वारा पुष्टि की गई.
Abstract
आक्रामक मूत्राशय कैंसर का एक preclinical मॉडल मानव mucin 1 (MUC1) immunotherapy और / या साइटोटोक्सिक कीमोथेरेपी का मूल्यांकन करने के उद्देश्य के लिए ट्रांसजेनिक (MUC1.Tg) चूहों में विकसित किया गया था. मूत्राशय कैंसर, C57BL 6 / चूहों (MUC1.Tg और जंगली प्रकार) 3.0 मिलीग्राम / दिन पर कैसरजन एन butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) के साथ मौखिक रूप से इलाज किया गया, 5 दिन / सप्ताह प्रेरित करने के लिए 12 सप्ताह के लिए. ट्यूमर के विकास के दौरान सीरम साइटोकाइन प्रोफाइल पर OH-BBN के प्रभाव का आकलन करने के लिए, पूरे रक्त अवअधोहनुज उपचार करने से पहले bleeds और हर चार सप्ताह के माध्यम से एकत्र की गई थी. इसके अलावा, एक MUC1 लक्षित पेप्टाइड टीका और प्लेसबो आठ सप्ताह के लिए साप्ताहिक चूहों के समूह को दिलाई गई. ट्यूमर के विकास और निम्नलिखित टीकाकरण के दौरान सीरम साइटोकिन्स के मल्टीप्लेक्स fluorometric microbead immunoanalyses प्रदर्शन किया गया. समाप्ति पर, इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) / MUC1 विशेष टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ट्यूमर के प्रकार का histopathological मूल्यांकन के लिए इंटरल्यूकिन 4 (आईएल -4) ELISpot विश्लेषणऔर ग्रेड प्रदर्शन किया गया. नतीजे बताते हैं कि: (1) MUC1.Tg और जंगली दोनों प्रकार चूहों में मूत्राशय के कैंसर की घटनाओं में 67% थी, (2) एक 2:1 के अनुपात में विकसित संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (टीसीसी) स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) की तुलना , (3) भड़काऊ साइटोकिन्स ट्यूमर के विकास के दौरान समय के साथ वृद्धि हुई है, और (4) पेप्टाइड वैक्सीन के प्रशासन के एक Th1-ध्रुवीकृत सीरम साइटोकाइन प्रोफाइल और एक MUC1 विशेष टी सेल प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. MUC1.Tg चूहों में सभी ट्यूमर MUC1 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक थे, और MUC1.Tg और जंगली प्रकार चूहों में ट्यूमर के आधे आक्रामक थे. अंत में, pharmacologists, प्रतिरक्षाविज्ञानी, पैथोलॉजिस्ट और आणविक जीव के प्रयासों के समन्वय के माध्यम से एक टीम के दृष्टिकोण का उपयोग कर, हम hMUC1 व्यक्त करता है कि मूत्राशय के कैंसर का एक प्रतिरक्षा बरकरार ट्रांसजेनिक माउस मॉडल विकसित किया है.
Introduction
मूत्राशय कैंसर के कैंसर के चौथे सबसे आम रूप है और अमेरिकी पुरुषों में कैंसर से होने वाली मौतों के आठवें प्रमुख कारण है. संयुक्त राज्य अमेरिका में, मूत्राशय के कैंसर से एक अनुमान के अनुसार 72,500 नए मामले और 15,000 लोगों की मृत्यु 2013 1 में संयुक्त पुरुषों और महिलाओं के बीच उम्मीद कर रहे हैं. मूत्राशय के कैंसर की घटनाओं में महिलाओं की तुलना में लगभग तीन गुना पुरुषों में उच्च के रूप में है. मामलों के 90% से अधिक के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका में, संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (टीसीसी) खाते, स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) 2% से कम 2 की एक घटना है, जबकि. इल्लों टीसीसी के लिए समग्र सापेक्ष 5 साल की जीवित रहने की दर एस सी सी 2 के लिए केवल 30.9% की तुलना में 91.5% है. Noninvasive इल्लों TCCs भी रोगियों का 50% से उपचार अधिक मांसपेशी इनवेसिव रोग 3,4 के लिए प्रगति इन रोगियों के 30% अप करने के साथ, 5 साल के भीतर एक पुनरावृत्ति अनुभव होगा साथ, निदान के समय में मामलों की लगभग 75% के लिए खाते में हालांकि . गैर मांसपेशी निवेश संबंधी निर्णय के लिए विशिष्ट उपचार regimensasive रोग intravesical रसायन चिकित्सा के बाद transurethral लकीर (अरहर) शामिल हैं. उच्च ग्रेड टा या T1 ट्यूमर के साथ रोगियों में, एक दोहराने अरहर कीमोथेरेपी 3,4 करने से पहले किया जा सकता है. कम ग्रेड टा पुनरावृत्ति या उच्च ग्रेड टा या T1 घावों के साथ उन रोगियों के लिए, अरहर Calmette-Guerin (बीसीजी) 3,4 इस्तेमाल किया जा सकता है बैसिलस के रूप में सहायक कीमोथेरेपी या immunotherapy के द्वारा पीछा किया. Intravesical बीसीजी पुनरावृत्ति 5 से समय के लिए सम्मान के साथ intravesical mitomycin सी से बेहतर होना दिखाया गया है. टी 2 मांसपेशी आक्रामक रोग के लिए, neoadjuvant कीमोथेरेपी के साथ या बिना कट्टरपंथी cystectomy उपचार 3 की सिफारिश की पाठ्यक्रम है. एस सी सी के साथ रोगियों में, कट्टरपंथी cystectomy सबसे प्रभावी उपचार 6 प्रतीत होता है. सबसे अच्छा उपचार उपलब्ध के बावजूद पुनरावृत्ति की बहुत उच्च दर को देखते हुए, मूत्राशय के कैंसर के लिए नए और अधिक प्रभावी उपचार के लिए एक की जरूरत स्पष्ट रूप से नहीं है.
Bladd के लिए नए immunotherapies के विस्तारएर कैंसर रोग से मुक्त अस्तित्व को विस्तार देने के लिए वादा पकड़ सकता है कि एक संभव दृष्टिकोण है. ऐतिहासिक, बीसीजी मूत्राशय कैंसर के लिए ही प्रभावी प्रतिरक्षा चिकित्सा की गई है. कार्रवाई के अपने तंत्र में वृद्धि इंटरल्यूकिन -2 के स्तर (आईएल -2) और इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) 4 के माध्यम से एक टी सहायक 1 (Th1) प्रकार प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अविशिष्ट प्रेरण शामिल माना जाता है. सेलुलर, या Th1 प्रतिरक्षा, त्रिदोषन, या Th2 के रूप में कैंसर immunotherapy में महत्वपूर्ण है, उन्मुक्ति वृद्धि कारक रिसेप्टर्स 7 के खिलाफ एंटीबॉडी के अपवाद के साथ, ठोस ट्यूमर के खिलाफ प्रभावी होना दिखाया गया है कभी नहीं. बीसीजी monotherapy के लाभ पर सुधार करने की कोशिश में, IFN-α 2B/BCG संयोजन प्रतिरक्षा चिकित्सा अनिर्णायक परिणाम 8 के साथ एक चरण द्वितीय चिकित्सीय परीक्षण में मूल्यांकन किया गया था. मूत्राशय कैंसर के लिए प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण 7 कैंसर immunotherapy अधिक विशिष्ट बना दिया है पहचान जिनमें से ट्यूमर जुड़े एंटीजन (TAAs), लक्षित करने के लिए हो सकता है </s> ऊपर.
ऐसा ही एक TAA इस तरह के मूत्राशय, स्तन, फेफड़े, और अग्नाशय के कैंसर 9,10 के रूप में कई उपकला सेल कैंसर में overexpressed एक कोशिका की सतह ग्लाइकोप्रोटीन है जो mucin 1 (MUC1), है. MUC1 की अभिव्यक्ति और संशोधन भी काफी carcinogenesis के दौरान बदल दिया है, कि इस तरह के underglycosylation पेप्टाइड कोर पर मिलकर दोहराता के चर संख्या (VNTR) के रूप में जाना जाता अमीनो एसिड की प्रतिजनी दृश्यों को उजागर करता है. MUC1 एक आत्म अणु है, वहीं इन immunodominant VNTR क्षेत्रों में सामान्य रूप से होने के कारण व्यापक ग्लाइकोसिलेशन को उजागर नहीं कर रहे हैं, और इस तरह वे विदेशी 11,12 के रूप में प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा देखा जाता है. विशेष रूप से MUC1 एपिटोप्स समझते हैं कि साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs) MUC1 एक के लिए एक संभावित लक्ष्य बना रही है, स्तन कैंसर के रोगियों के 13, साथ ही myeloma रोगियों 14,15 के रक्त और अस्थि मज्जा का ट्यूमर draining लिम्फ नोड्स से अलग कर दिया गया है सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है. underglycosylate की immunodominant VNTRsMUC1 की घ प्रपत्र 16-19 ट्यूमर कोशिकाओं के विनाश में जिसके परिणामस्वरूप, CTLs द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. कैंसर MUC1 के मूल निवासी सेलुलर और / या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, तथापि, ट्यूमर को खत्म करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं कर रहे हैं. MUC1 के लिए पहले से ही विद्यमान कमजोर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए, सिंथेटिक immunodominant पेप्टाइड्स नैदानिक लाभ 18,20 का होना काफी मजबूत करने के लिए एक सीटीएल प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए टीकाकरण के माध्यम से पेश किया जा सकता है. एक MUC1 लिपोसोमल टीका पहले से ही, फेफड़ों के कैंसर के रोगियों 21,22 में अस्तित्व में वृद्धि MUC1 पॉजिटिव ट्यूमर कोशिकाओं को मारने में सक्षम CTLs उत्पन्न, और एक Th1-ध्रुवीकृत साइटोकाइन प्रतिक्रिया 23,24 उत्पादन दिखाया गया है. MUC1 अभिव्यक्ति 9,11,25 के एक उच्च स्तर के साथ, मूत्राशय कैंसर MUC1 का निर्देश प्रतिरक्षा चिकित्सा 26,27 के परीक्षण के लिए एक तार्किक उम्मीदवार है. इसके अलावा, MUC1 कैंसर 28, टीसीसी में MUC1 अभिव्यक्ति काफी मंच और ग्रेड के साथ जुड़ा हुआ है मूत्राशय में एक शकुन कारक के रूप में की क्षमता है, और metastatic टीसीसीMUC1 29 व्यक्त करने के लिए जारी रखने के लिए दिखाया गया है.
मूत्राशय कैंसर में MUC1 का निर्देश immunotherapy की क्षमता उपयोगिता का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक प्रतिरक्षा बरकरार मानव MUC1 (hMUC1) व्यक्त C57BL 6 / पृष्ठभूमि 30 मूत्राशय कैंसर congenic की ट्रांसजेनिक (MUC1.Tg) माउस मॉडल विकसित किया है. मानव MUC1 मनुष्य 30,31 में कहा कि संगत के साथ एक ऊतक अभिव्यक्ति पैटर्न में जिसके परिणामस्वरूप अपने स्वयं के प्रमोटर के नियंत्रण में एक आत्म – प्रोटीन, के रूप में व्यक्त किया जाता है. चूहों तो ज्ञात मूत्राशय कैसरजन एन butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) 32, और जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर hMUC1 अभिव्यक्ति और ट्यूमर के प्रकार और ग्रेड के लिए मूल्यांकन किया गया, साथ प्रेरित किया गया. ट्यूमर के विकास के दौरान Th1/Th2 साइटोकाइन के स्तर पर कैसरजन के प्रभाव का आकलन करने के लिए, सीरम नमूनों मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए समय समय पर एकत्र किए गए थे. चूहे तो एक MUC1 लक्षित पेप्टाइड वैक्सीन के साथ इलाज किया, और सीरम साइटोकाइन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया evalua थेमल्टीप्लेक्स fluorometric microbead immunoassay और ELISpot द्वारा टेड.
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव MUC1.Tg चूहों में आक्रामक संक्रमणकालीन और स्क्वैमस सेल मूत्राशय कार्सिनोमा के सफल प्रेरण Immunotherapy विकास के लिए एक preclinical मॉडल प्रदान करता है. Immunotherapeutic पढ़ाई समय के साथ ही प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए प्रतिरक्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों चूहों प्रजनन के लिए यूसी डेविस माउस जीवविज्ञान कार्यक्रम को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध मर्क KGaA, Darmstadt, जर्मनी से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
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