Induktion av invasiva Transitional Cell blåskarcinom i immuna intakt human MUC1 transgena möss: En modell för immunterapi utveckling
Summary
En N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin-inducerad blåscancer modell utvecklades i human mucin 1 (MUC1) transgena möss för att testa MUC1-riktad immunterapi. Efter administrering av en MUC1-riktad peptidvaccin, var en cytotoxisk T lymfocytsvaret MUC1 bekräftades genom mätning av serum cytokinnivåer och T-cell specifik aktivitet.
Abstract
En preklinisk modell av invasiv blåscancer utvecklades i human mucin 1 (MUC1) transgena (MUC1.Tg) möss för att utvärdera immunterapi och / eller cytostatika. För att inducera cancer i urinblåsan, C57BL / 6 möss (MUC1.Tg och vildtyp) behandlades oralt med cancerframkallande N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin (OH-BBN) vid 3,0 mg / dag, 5 dagar / vecka i 12 veckor. För att bedöma effekterna av OH-BBN på serum cytokinprofil under tumörutveckling, var helblod via submandibulära blödningar före behandling och var fjärde vecka. Dessutom gjordes en MUC1-riktad peptidvaccin och placebo administrerades till grupper av möss varje vecka i åtta veckor. Multiplex fluorometriska microbead immunoanalyses av serum cytokiner under tumörutveckling och efter vaccination utfördes. Vid uppsägning, interferon-gamma (IFN-γ) / interleukin-4 (IL-4) ELISpot analys för MUC1 specifik T-cells immunsvar och histopatologiska utvärderingar av tumörtypoch årskurs utfördes. Resultaten visade att: (1) förekomsten av blåscancer i både MUC1.Tg och vildtyp möss var 67%, (2) övergångsbestämmelser cell cancer (TCC) som utvecklats på en 2:1-förhållande jämfört med skivepitelcancer (SCC) , (3) inflammatoriska cytokiner ökade med tiden under tumörutveckling, och (4) administrering av peptiden Vaccinet inducerar en Th1-polariserad serum cytokinprofil och en MUC1 specifik T-cellsvar. Alla tumörer i MUC1.Tg möss var positiva för MUC1 uttryck, och hälften av alla tumörer i MUC1.Tg och vildtyp möss invasiv. Sammanfattningsvis, med hjälp av ett lagarbete genom samordning av insatserna från farmakologer, immunologists, patologer och molekylärbiologer, har vi utvecklat ett immunförsvar intakt transgen musmodell av cancer i urinblåsan som uttrycker hMUC1.
Introduction
Cancer i urinblåsan är den fjärde vanligaste cancerformen och den åttonde vanligaste orsaken till dödsfall i cancer i amerikanska män. I USA finns uppskattningsvis 72.500 nya fall och 15.000 dödsfall i cancer i urinblåsan väntat bland män och kvinnor tillsammans under 2013 1. Förekomsten av cancer i urinblåsan är ungefär tre gånger så hög hos män jämfört med kvinnor. I USA, övergångsbestämmelser cell cancer (TCC) står för över 90% av fallen, medan skivepitelcancer (SCC) har en incidens på mindre än 2% 2. Den totala relativa 5-års överlevnad för papillär TCC är 91,5% jämfört med endast 30,9% för SCC 2. Även icke-invasiv papillär TCCS svarar för cirka 75% av fallen vid tidpunkten för diagnos, även med behandling mer än 50% av patienterna kommer att uppleva ett återfall inom fem år, med upp till 30% av dessa patienter vidare till muskel invasiv sjukdom 3,4 . Typiska behandlingsregimer för icke-muskel invasive sjukdom inkluderar transuretral resektion (TUR) följt av intravesikal kemoterapi. Hos patienter med höggradig Ta eller T1 tumörer, kan en upprepning TUR göras före kemoterapi 3,4. För de patienter med låggradig Ta upprepningar eller höggradig Ta eller T1 lesioner, följt TUR av adjuvant kemoterapi eller immunterapi i form av Bacillus Calmette-Guerin (BCG) kan användas 3,4. Intravesikal BCG har visat sig vara överlägsen intravesikal mitomycin C med avseende på tid till återfall 5. För T2 muskel invasiv sjukdom, är radikal cystektomi med eller utan neoadjuvant kemoterapi är den rekommenderade behandlingen 3. Hos patienter med SCC förefaller radikal cystektomi för att vara den mest effektiva behandlingen 6. Med tanke på de mycket höga återfall trots de bästa behandlingar som är tillgängliga, det finns helt klart ett behov av nya, mer effektiva behandlingar för cancer i urinblåsan.
Expanderande nya immunterapier för bladdER cancer är en möjlig strategi som kan hålla löftet att utvidga sjukdomsfri överlevnad. Historiskt sett har BCG varit den enda effektiva immunterapi för cancer i urinblåsan. Dess verkningsmekanism är tänkt att involvera ospecifik induktion av en T-helper 1 (Th1) typ immunsvar via ökade nivåer av interleukin-2 (IL-2) och interferon-gamma (IFN-γ) 4. Cellular, eller Th1 immunitet, är kritisk i cancer immunoterapi som humoralt eller Th2, har immunitet aldrig visat sig vara effektivt mot fasta tumörer, med undantag för antikroppar riktade mot tillväxtfaktorreceptorer 7. I ett försök att förbättra nyttan av BCG monoterapi, fick IFN-α 2B/BCG kombination immunterapi utvärderas i en fas II-studie med osäkra resultat 8. En alternativ metod för immunterapi för cancer i urinblåsan kan vara att rikta tumör-associerade antigener (TAA), identifiering av vilket har gjort cancerimmunotherapy mer specifik 7 </supp>.
En sådan TAA är mucin 1 (MUC1), som är ett cellyteglykoprotein överuttryckt i många epitelceller cancerformer såsom urinblåsa, bröst, lunga, och pankreascancer 9,10. Uttrycket och modifiering av MUC1 också ändras väsentligt under karcinogenes, exponerar så att underglycosylation antigena sekvenser av aminosyror kallas varierande antal tandem repeats (VNTR) på peptiden kärnan. Medan MUC1 är en self-molekyl, är dessa immundominanta VNTR regioner som inte normalt utsätts för på grund av omfattande glykosylering, och därmed de ses av immunsystemet som främmande 11,12. Cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) som specifikt känner igen MUC1 epitoper har isolerats från tumör-dränerande lymfkörtlar av bröstcancerpatienter 13, såväl som blod och benmärg från myelomatålmodig 14,15, vilket gör MUC1 ett potentiellt mål för en cellulärt immunsvar. De immundominanta VNTRs av underglycosylated form av MUC1 känns igen av CTL, vilket resulterar i destruktion av tumörceller 16-19. Native cellulära och / eller humorala immunsvar mot cancerous MUC1 är emellertid inte tillräckligt starka för att eliminera tumörer. För att förstärka den redan existerande svagt immunsvar mot MUC1, kan syntetiska immundominanta peptider införas genom vaccination för att generera en CTL-svar stark nog att vara av klinisk nytta 18,20. En MUC1 liposomal vaccinet har redan visats öka överlevnaden hos lungcancerpatienter 21,22, generera CTL med förmåga att döda MUC1-positiva tumörceller, och producera en Th1-polariserad cytokin respons 23,24. Med en hög nivå av MUC1 expression 9,11,25, är blåscancer en logisk kandidat för testning MUC1-riktad immunterapi 26,27. Dessutom har MUC1 potential som en prognostisk faktor vid blåscancer 28, MUC1 uttryck i TCC är signifikant associerade med stadium och grad, och metastaserande TCChar visats för att fortsätta att uttrycka MUC1 29.
För att utvärdera den potentiella nyttan av MUC1-riktad immunterapi i blåscancer, utvecklade vi en immun intakt human MUC1 (hMUC1)-uttryckande transgena (MUC1.Tg) musmodell av cancer i urinblåsan congenic på C57BL / 6 bakgrund 30. Human MUC1 uttrycks som ett kroppseget protein under kontroll av sin egen promotor, vilket resulterar i en vävnad uttryck mönster som överensstämmer med den som observerats hos människa 30,31. Mössen inducerades med den kända blåsan cancerframkallande N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin (OH-BBN) 32, och sedan de resulterande tumörerna utvärderades med avseende hMUC1 uttryck och tumör typ och kvalitet. För att bedöma effekten av cancerframkallande på Th1/Th2 cytokinnivåer under tumörutveckling, har serumprover samlas regelbundet för multiplex analys. Mössen behandlades sedan med en MUC1-riktad peptidvaccin, och serumet cytokin och immunsvar var utvärted genom multiplex fluorometrisk mikrokornet immunanalys och ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den framgångsrika induktion av invasiv övergångsperiod och skivepitelcancer blåskarcinom i mänskliga MUC1.Tg möss erbjuder en preklinisk modell för immunterapi utveckling. Immunterapi studier kräver användning av en spontan, immun intakt modell för att utvärdera det inflammatoriska svaret till tumörprogression över tid samt immunsvaret mot immunterapi. I en spontan tumör utvecklingsmodell, förblir tumormicroenvironmenten intakt och tumörer utvecklas i en mer representativ tillväxttakt som möjliggör be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka UC Davis Mus Biology Program för avel mössen. Denna forskning stöds av ett lån från Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
