Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese
Summary
Werkwijzen voor de manipulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke volwassen hippocampus neurogenese beschreven. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor een dentate gyrus-afhankelijke gedragstest (genoemd het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes doolhof) voor het onderzoek naar cognitieve uitkomst bij muizen. Deze techniek moet ook helpen onderzoek mogelijk te maken in andere experimentele instellingen.
Abstract
De hippocampus speelt een centrale rol in de vorming en consolidatie van episodische herinneringen, en in ruimtelijke oriëntatie. Historisch gezien is de volwassen hippocampus gezien als een statisch anatomisch gebied van de hersenen van zoogdieren. Echter, recente bevindingen aangetoond dat de dentate gyrus van de hippocampus is een gebied van enorme plasticiteit bij volwassenen, waarbij niet alleen wijzigingen van bestaande neuronale circuits, maar ook volwassen neurogenese. Deze plasticiteit wordt gereguleerd door complexe transcriptienetwerken, waarin de transcriptiefactor NF-kB speelt een belangrijke rol. Het bestuderen en manipuleren volwassen neurogenese, een transgeen muismodel voor voorhersenen specifieke neuronale inhibitie van NF-KB-activiteit kunnen worden gebruikt.
In deze studie, worden werkwijzen beschreven voor het analyseren van NF-kB-afhankelijke neurogenese, inclusief de structurele aspecten, neuronale apoptose en proliferatie van voorlopercellen en cognitieve betekenis which werd speciaal via een dentate gyrus (DG)-afhankelijke gedragstest, het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes maze (SPS-BM) beoordeeld. Het SPS-BM protocol kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met andere transgene diermodellen ontworpen om de invloed van bepaalde genen op volwassen hippocampus neurogenese beoordelen. Bovendien kan SPS-BM worden gebruikt in andere experimentele instellingen wil nagaan en manipuleren DG-afhankelijk leren, bijvoorbeeld met farmacologische middelen.
Introduction
Ontologisch, de hippocampus is een van de oudste anatomische hersenstructuren bekend. Het is verantwoordelijk voor diverse complexe taken, zoals het centrale functie in de regulatie van de lange-termijn geheugen, ruimtelijke oriëntatie, en de vorming en consolidatie van het betreffende geheugen. Anatomisch, de hippocampus bestaat uit piramidale cellagen (stratum pyramidale) met inbegrip van de cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 en CA4) regio's en de dentate gyrus (gyrus dentatus), die granule cellen en enkele neuronale voorlopercellen binnen haar subgranulaire zone bevat . De granule cellen projecteren naar het gebied CA3 via de zogenaamde bemoste vezels (axons van granule cellen).
Tot het einde van de vorige eeuw, werd de volwassen hersenen van zoogdieren verondersteld om een statisch orgaan ontbreekt cellulaire plasticiteit en neurogenese zijn. Echter, tijdens de laatste twee decennia een groeiende hoeveelheid bewijs toont volwassen neurogenese plaats in duidelijk minstenstwee hersengebieden, de subventriculaire zone (SVZ) en de subgranulaire zone van de hippocampus.
Onze eerdere studies, en die van andere groepen hebben aangetoond dat de transcriptiefactor NF-KB is een van de cruciale moleculaire regulatoren van volwassen neurogenese, en dat de deregulering leidt tot ernstige structurele hippocampale afwijkingen en cognitieve stoornissen 1-6. NF-KB is de generieke naam van een induceerbare transcriptiefactor uit verschillende dimere combinaties van vijf DNA-bindende subeenheden: p50, P52, c-Rel, RelB en p65 (RelA), de laatste drie daarvan met transactiveringsdomeinen. In de hersenen, de meest voorkomende vorm in het cytoplasma is een heterodimeer van p50 en p65, die in een inactieve vorm wordt gehouden door inhibitor van kappa B (IKB)-eiwitten.
Te bestuderen en rechtstreeks manipuleren NF-kB-driven neurogenese, maken we gebruik van transgene muismodellen voor de eenvoudige remming van alle van de NF-kB subun staatzijn, met name in de voorhersenen 7 (zie figuur 1). Voor dit doel hebben we gekruist de volgende transgene muis lijnen, IKB / – en -/tTA. De transgene IKB / – lijn werd gegenereerd met behulp van een trans-dominant negatieve mutant van NF-kB-remmer IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8. In tegenstelling tot het wildtype IKBa, IKBa-AA1 twee serine residuen gemuteerd naar alanines (V32 en V36), die de fosforylering en daaropvolgende proteasomale degradatie van de remmer belemmeren. Voor voorhersenen neuron-specifieke expressie van de IκBa-AA1-transgen, IKB / – muizen werden gekruist met muizen die een calcium-calmodulin-afhankelijke kinase IIα (CAMKIIα)-promotor die kan worden aangedreven door tetracycline trans-activator (TTA) 9.
p65 knock-out muizen een embryonaal lethaal fenotype wegens massieve apoptose lever 10, zodat de hier getoonde aanpak biedt een elegante methodehet onderzoek naar de rol van NF-KB in postnatale en volwassen neurogenese.
De klassieke gedragstest ruimtelijke leren en geheugen te bestuderen werd in de jaren 1980 beschreven door Richard Morris, een test bekend als de Morris water-maze (MWM) 11. In deze open-veld water-doolhof, dieren leren om te ontsnappen aan ondoorzichtige water op een verborgen platform op basis van oriëntatie en extra-doolhof cues. Een droge variant van MWM is de zogenaamde Barnes doolhof (BM) 12. Deze test maakt gebruik van een ronde plaat met 20 ronde gaten aangebracht aan de rand van een plaat, met een gedefinieerd gat als een ontsnapping doos, en visuele extra-doolhof signalen voor oriëntatie. Zowel experimentele paradigma's vertrouwen op het gedrag vlucht veroorzaakt door een knaagdier `s afkeer van water, of open en helder verlichte ruimtes. Beide tests laten een onderzoek naar ruimtelijke oriëntatie, en de daarmee verband houdende geheugenprestaties. Hoewel de hippocampus speelt een algemene en essentiële rol in de ruimtelijke vorming van het geheugen, de hippocampus rgewesten betrokken verschillen afhankelijk van de gebruikte test. Het geheugen getest BM voortvloeit uit neuronale activiteit tussen de enthorinal cortex (EC) en de piramidale neuronen in het CA1-gebied van de hippocampus zonder bijdrage van DG 13-16. Met name de klassieke BM berust vooral op navigatie via de monosynaptic temporo-ammonic weg van EG III CA1 EG V. Belangrijk is DG cruciaal betrokken bij de zogenaamde ruimtelijk patroonherkenning 17, die niet alleen de verwerking impliceert visuele en ruimtelijke informatie, maar ook de transformatie van soortgelijke verklaringen of herinneringen in ongelijksoortige, niet-overlappende representaties. Deze taak vereist een functionele tri-synaptische circuit van EC II DG om CA3 naar CA1 en EG VI, die niet kunnen worden getest in de BM 15.
Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we SPS-BM bedacht als een gedragstest om specifiek te testen dentate gyrus-afhankelijke cognitieve prestaties in control dieren en met de IKB / tTA super-repressor model na NF-KB-inhibitie. Belangrijk is, in tegenstelling tot de MWM of BM, de SPS-BM subtiele gedragstekorten gevolg van aantasting van neurogenese onthullen. Sinds ruimtelijk-patroon-scheiding is strikt afhankelijk van een functioneel circuit tussen EC II en DG en CA3 en CA1 en EG VI, deze test is zeer gevoelig voor potentiële veranderingen in neurogenese, wijzigingen van het bemoste vezels pad of wijzigingen van weefsel homeostase binnen de DG.
Technisch gezien is de set-up van onze test op basis van de studie van Clelland et al.., Waarin de ruimtelijke scheiding patroon werd getest met behulp van een houten 8-arm radiale arm doolhof (RAM) 19. In onze gewijzigde set-up, werden de acht armen vervangen door zeven identieke gele voedsel huizen. Kortom, hier de methoden getoond, inclusief een analyse van-doublecortin uitdrukken (DCX +) cellen in de hippocampus, de mosvezel projecties, neuronale cel death en met name de SPS-BM gepresenteerd hier, kan worden toegepast op onderzoeken van andere muismodellen waarin transgenen die een impact hebben op volwassen neurogenese hebben. Verdere toepassingen kan de bestudering van farmacologische middelen en het meten van hun impact op de DG en ruimtelijk patroon scheiding omvatten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Volwassen neurogenese en de mogelijkheid van een manipulatie door remming van NF-KB in neuronen en de latere reactivering via doxycycline, biedt een fascinerende voor onderzoek naar pasgeboren neuronen in de volwassen hersenen, alsook in neuronale de-en regeneratie . Het mooie van dit systeem is dat NF-kB signaling pathway remming in neuronen niet alleen tot veranderingen in neuronale celdood, progenitor proliferatie en migratie, en ernstige structurele en anatomische veranderingen, maar ook evidente defecten leren. Bel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Angela Kralemann-Köhler voor een uitstekende technische ondersteuning. Experimenteel werk hierin beschreven werd uitgevoerd in ons laboratorium en werd ondersteund door subsidies van de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG) CK en BK en een subsidie van het Duitse ministerie van Onderzoek en Onderwijs (BMBF) aan BK.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
References
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. . Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
