Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis
Summary
Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais.
Abstract
O hipocampo desempenha um papel fundamental na formação e consolidação de memórias episódicas, e na orientação espacial. Historicamente, o hipocampo adulto foi visto como uma região anatómica muito estático do cérebro de mamíferos. No entanto, resultados recentes demonstraram que o giro denteado do hipocampo é uma área de grande plasticidade em adultos, que envolva não apenas modificações de circuitos neuronais existentes, mas também a neurogénese adulto. Esta plasticidade é regulada por redes complexas de transcrição, em que o factor de transcrição NF-kB desempenha um papel proeminente. Para estudar e manipular neurogenesis adulto, um modelo de ratinho transgénico para-específica do cérebro anterior inibição neuronal da actividade de NF-kB pode ser usado.
Neste estudo, são descritos métodos para a análise da neurogénese NF-kB-dependentes, incluindo os seus aspectos estruturais, apoptose neuronal e a proliferação de células progenitoras, e significância cognitiva, which foi especificamente avaliada através de um giro denteado (DG) dependente teste comportamental, o padrão de separação espacial-Barnes labirinto (SPS-BM). O protocolo SPS-BM poderia ser simplesmente adaptados para uso com outros modelos animais transgênicos destinados a avaliar a influência de genes específicos em neurogênese adulta. Além disso, o SPS-BM poderia ser usado em outras configurações experimentais com vista a investigar e manipular aprendizagem DG-dependentes, por exemplo, por meio de agentes farmacológicos.
Introduction
Ontologicamente, o hipocampo é um dos mais antigos estruturas anatómicas cerebrais conhecidos. Ele é responsável por diversas tarefas complexas, tais como funções fundamentais na regulação da memória de longo prazo, a orientação espacial ea formação e consolidação da respectiva memória. Anatomicamente, o hipocampo é constituído por camadas de células piramidais (estrato piramidal), incluindo o cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, e CA4) e regiões do giro dentado (gyrus dentatus), que contém as células granulares e alguns progenitores neuronais dentro da sua zona subgranular . As células granulares projectar em direcção à região CA3 através das ditas fibras musgosas (axónios de células granulares).
Até o final do século passado, cérebro de mamíferos adultos se acreditava ser um órgão estático falta plasticidade celular e neurogênese. No entanto, durante as duas últimas décadas, uma quantidade crescente de evidências demonstra claramente a neurogênese adulta ocorrendo em pelo menosduas regiões do cérebro, da zona subventricular (SVZ) e a zona subgranular do hipocampo.
Nossos estudos anteriores, e das de outros grupos, têm mostrado que o fator de transcrição NF-kB é um dos reguladores moleculares cruciais da neurogênese adulta, e que os seus resultados de-regulação em defeitos estruturais do hipocampo graves e deficiências cognitivas 1-6. NF-B é o nome genérico de um factor de transcrição indutível composto por diferentes combinações diméricos de cinco subunidades de ligação ao ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), o último dos quais tem três domínios de transactivação. Dentro do cérebro, a forma mais abundante encontrada no citoplasma é um heterodímero de p50 e p65, que é mantido sob uma forma inactiva, por inibidor de kappa B (IkB)-proteínas.
Para estudar e manipular diretamente neurogênese NF-kB-driven, usamos modelos de camundongos transgênicos para permitir simples inibição de toda a subun NF-kBsua, especificamente no cérebro anterior 7 (ver Figura 1). Para este fim, nós Cruzado as seguintes linhas camundongo transgênico, IkB / – e -/tTA. O transgênico IkB / – linha foi gerada usando um mutante negativo trans-dominante do NF-kB-inibidor IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8. Em contraste com o do tipo selvagem IκBα, IκBα-AA1 tem dois resíduos de serina mutados para alaninas (V32 e V36), os quais impedem a fosforilação e subsequente degradação proteosomal do inibidor. Para prosencéfalo expressão específica do neurônio do IκBa-AA1-transgene, IkB / – ratos foram cruzadas com ratos abrigar uma quinase cálcio-calmodulina-dependente IIα (CAMKIIα)-promotor que pode ser conduzido por tetraciclina trans-ativador (ATT) 9.
p65 camundongos knock-out ter um fenótipo letal embrionário, devido à maciça apoptose hepática 10, então a abordagem mostrada aqui fornece um método elegantepara investigar o papel do NF-kB em pós-natal e neurogênese adulta.
O teste comportamental clássica para estudar a aprendizagem espacial ea memória foi descrita em 1980 por Richard Morris, um teste conhecido como a água-labirinto Morris (MWM) 11. Neste campo aberto água-labirinto, os animais aprendem a escapar da água opaca sobre uma plataforma escondida com base na orientação e extra-labirinto pistas. Uma variante de seco da MWM é o chamado labirinto Barnes (BM) 12. Este teste utiliza uma placa circular com 20 orifícios circulares dispostas na fronteira de uma placa com um furo definida como uma caixa de fuga, e visuais pistas extra-labirinto de orientação. Ambos os paradigmas experimentais dependem do comportamento de fuga induzido por um roedor `s aversão à água, ou espaços abertos, brilhantemente iluminados. Ambos os testes permitem que uma investigação de orientação espacial, eo desempenho da memória relacionada. Embora o hipocampo desempenha um papel em geral e fundamental na formação da memória espacial, o hipocampo rEGIÕES envolvidos diferem dependendo do teste aplicado. A memória testada em BM surge da atividade neuronal entre o córtex enthorinal (CE) e os neurônios piramidais localizados no CA1-região do hipocampo, sem uma contribuição da DG 13-16. Em particular, o clássico BM depende principalmente da sua navegação através da via temporo-ammonic monossináptico de CE III CA1 para CE V. Mais importante, o DG é crucialmente envolvido no chamado reconhecimento do padrão espacial 17, o que implica não só o tratamento de informação visual e espacial, mas também a transformação das representações ou memórias semelhantes em diferentes representações, não sobrepostas. Esta tarefa exige um circuito tri-sináptico funcional do CE II DG para CA3 para CA1 e CE VI, que não podem ser testados na BM 15.
Para enfrentar esses desafios, nós planejamos SPS-BM como um teste comportamental para testar especificamente o desempenho cognitivo denteado dependente de giro em control animais, e no modelo de super-repressora de IkB / tTA a inibição do NF-kB. Importante, em contraste com a MWM ou o BM, o SPS-BM pode revelar déficits comportamentais sutis resultantes da diminuição da neurogênese. Desde espacial-padrão de separação é estritamente dependentes de um circuito funcional entre EC II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, este teste é altamente sensível a mudanças potenciais na neurogênese, modificações da via fibra de musgo ou alterações de homeostase do tecido dentro do DG.
Tecnicamente, a configuração do nosso teste baseia-se no estudo de Clelland et al., Em que o padrão de separação espacial foi testado utilizando uma madeira de 8 braços do labirinto radial do braço (RAM) 19. Em nossa modificado set-up, os oito braços foram substituídos por sete casas amarelas idênticas alimentos. Em resumo, os métodos mostrados aqui, incluindo a análise de células que expressam doublecortin (DCX +) dentro do hipocampo, as projeções de fibras musgosas, neuronal de células deatletas e, particularmente, o SPS-BM apresentado aqui, pode ser aplicado a investigações de outros modelos de mouse incorporando transgenes que têm um impacto sobre a neurogênese adulta. Outras aplicações podem incluir o estudo de agentes farmacológicos e medir o seu impacto sobre a separação padrão DG e espacial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neurogênese adulta, ea possibilidade de sua manipulação através da inibição do NF-kB nos neurônios, e sua reativação posterior através doxiciclina, oferece um sistema fascinante para as investigações sobre os neurônios recém-nascidos no cérebro adulto, bem como em neuronal de-e re-geração . A beleza desse sistema é que a inibição de NF-kB via de sinalização nos neurônios não só resulta em mudanças na morte neuronal, proliferação e migração de células progenitoras, e as mudanças estruturai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Angela Kralemann-Köhler para excelente suporte técnico. O trabalho experimental aqui descrito foi realizado em nosso laboratório e foi apoiado por subsídios do Conselho Alemã de Pesquisa (DFG) para CK e BK e uma concessão do Ministério alemão da Educação e Pesquisa (BMBF) para BK.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
References
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