Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi
Summary
Sono descritti metodi per la manipolazione e l'analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali.
Abstract
L'ippocampo gioca un ruolo fondamentale nella formazione e il consolidamento dei ricordi episodici, ed in orientamento spaziale. Storicamente, l'ippocampo adulto è stato visto come una regione anatomica molto statica del cervello dei mammiferi. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che il giro dentato dell'ippocampo è un'area di enorme plasticità negli adulti, coinvolgendo non solo le modificazioni dei circuiti neuronali esistenti, ma anche neurogenesi adulta. Questa plasticità è regolata da reti trascrizionali complesse, in cui il fattore di trascrizione NF-kB gioca un ruolo di primo piano. Per studiare e manipolare neurogenesi adulta, un modello di topo transgenico per l'inibizione neuronale specifico proencefalo dell'attività di NF-kB può essere utilizzato.
In questo studio, sono descritti metodi per l'analisi di neurogenesi NF-kB-dipendente, compresi gli aspetti strutturali, apoptosi neuronale e progenitore proliferazione e significato cognitivo; la cucih specificamente è stato valutato attraverso un giro dentato (DG)-dipendente prova comportamentale, il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale (SPS-BM). Il protocollo SPS-BM potrebbe essere adattato solo per l'uso con altri modelli animali transgenici destinati a valutare l'influenza di particolari geni adulti neurogenesi ippocampale. Inoltre, SPS-BM potrebbe essere utilizzata in altre condizioni sperimentali intesi a studiare e manipolare apprendimento DG-dipendente, ad esempio, utilizzando agenti farmacologici.
Introduction
Ontologicamente, l'ippocampo è una delle più antiche strutture cerebrali anatomiche conosciuti. E 'responsabile di diversi compiti complessi, come le funzioni cardine nella regolazione della memoria a lungo termine, l'orientamento spaziale, e la formazione e il consolidamento della rispettiva memoria. Anatomicamente, l'ippocampo è costituito da strati di cellule piramidali (strato piramidale), tra cui il cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 e CA4), regioni ed il giro dentato (giro Dentato), che contiene granuli e alcuni progenitori neuronali nella propria zona di subgranular . Le cellule granulari proiettano verso la regione CA3 tramite le cosiddette fibre di muschio (assoni delle cellule granulari).
Fino alla fine del secolo scorso, il cervello dei mammiferi adulti è stato creduto di essere un organo statico privo di plasticità e neurogenesi cellulare. Tuttavia, durante gli ultimi due decenni, una crescente quantità di prove dimostra chiaramente neurogenesi adulta si svolgono in almenodue regioni del cervello, la zona subventricolare (SVZ) e la zona subgranulare dell'ippocampo.
I nostri studi precedenti, e quelli di altri gruppi, hanno dimostrato che il fattore di trascrizione NF-kB è uno dei regolatori molecolari cruciali della neurogenesi adulta, e che i suoi risultati de-regolazione di gravi difetti strutturali dell'ippocampo e menomazioni cognitive 1-6. NF-kB è il nome generico di un fattore di trascrizione inducibile composto da diverse combinazioni dimeriche di cinque-DNA-binding subunità: P50, P52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), gli ultimi tre dei quali hanno domini di transattivazione. All'interno del cervello, la forma più abbondante nel citoplasma è un eterodimero di p50 e p65, che viene mantenuto in una forma inattiva da inibitore di kappa B (IkB)-proteine.
Per studiare e manipolare direttamente neurogenesi NF-kB-driven, usiamo modelli di topi transgenici per consentire semplice inibizione di tutti i subun NF-kBsua, specificamente nel proencefalo 7 (vedi figura 1). A questo scopo, abbiamo Incrocio le seguenti linee di topo transgenico, IkB / – e -/tTA. Il transgenico IkB / – linea è stata generata utilizzando un mutante negativo trans-dominante di NF-kB-inibitore IκBa (super-repressore IκBa-AA1) 8. In contrasto con il wild-type IκBα, IκBα-AA1 è dotato di due residui di serina mutati di alanina (V32 e V36), che ostacolano la fosforilazione e la successiva degradazione del proteasoma dell'inibitore. Per prosencefalo espressione di specifici neuroni del IκBa-AA1-transgene, IkB / – topi sono stati incrociati con i topi ospitare una chinasi calcio-calmodulina-dipendente IIα (CAMKIIα)-promotore che può essere guidato da tetraciclina trans-attivatore (AS) 9.
p65 topi knock-out hanno un fenotipo letale embrionale, a causa della massiccia apoptosi fegato 10, quindi l'approccio qui illustrato fornisce un metodo eleganteper indagare il ruolo di NF-kB in postnatale e neurogenesi adulta.
Il test classico comportamentale per studiare l'apprendimento spaziale e la memoria è stata descritta nel 1980 da Richard Morris, un test noto come Morris water-maze (MWM) 11. In questo open-campo di acqua-labirinto, animali imparano a fuggire da acqua opaca su una piattaforma nascosta basata su orientamento ed extra-labirinto spunti. Una variante secca MWM è il cosiddetto labirinto Barnes (BM) 12. Questo test utilizza una piastra circolare con 20 fori circolari disposti al confine di un piatto, con un foro definito come una scatola di fuga, e visivi spunti extra-labirinto per l'orientamento. Entrambi i paradigmi sperimentali si basano sul comportamento in volo indotto da un roditore `s avversione per l'acqua, o spazi aperti e luminosi illuminati. Entrambi i test permettono un'indagine di orientamento spaziale, e le prestazioni della memoria correlati. Sebbene l'ippocampo gioca un ruolo generale ed essenziale nella formazione della memoria spaziale, l'ippocampo rEGIONI coinvolti variano a seconda del test applicato. La memoria testato in BM deriva da attività neuronale tra la corteccia enthorinal (CE) ei neuroni piramidali situate nella regione CA1 dell'ippocampo senza il contributo della DG 13-16. In particolare, il classico BM si basa principalmente sulla navigazione tramite temporo-ammonico percorso monosinaptico da CE III CA1 CE V. È importante sottolineare che il DG è cruciale coinvolto nella cosiddetta pattern recognition spaziale 17, che non solo comporta il trattamento dei informazioni visive e spaziali, ma anche la trasformazione di rappresentazioni o di ricordi simili in rappresentazioni dissimili, non sovrapposti. Questo compito richiede un circuito tri-sinaptica funzionale da CE II alla DG per CA3 a CA1 e CE VI, che non può essere provato nel BM 15.
Per affrontare queste sfide, abbiamo ideato SPS-BM come test comportamentali per verificare specificamente le prestazioni giro-dipendente dentate cognitive in collaborazioneanimali ntrol, e nel modello super-repressore IkB / tTA seguente inibizione di NF-kB. È importante sottolineare che, in contrasto con la MWM o la BM, il SPS-BM può rivelare sottili deficit comportamentali derivanti dal deterioramento della neurogenesi. Poiché spaziale-modello-separazione è strettamente dipendente da un circuito funzionale tra CE II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, questo test è altamente sensibile a potenziali cambiamenti di neurogenesi, modifiche del percorso fibra di muschio o alterazioni dell'omeostasi del tessuto all'interno del DG.
Tecnicamente, il set-up del nostro test si basa sullo studio da Clelland et al., In cui il modello di separazione spaziale è stato testato utilizzando un legno 8-braccio braccio radiale labirinto (RAM) 19. Nel nostro modificata set-up, le otto bracci sono stati sostituiti da sette identici alimento case gialle. In sintesi, i metodi qui riportate, compresa l'analisi dei DCX (+), le cellule-doublecortin esprimono all'interno dell'ippocampo, le proiezioni in fibra di muschio, neuronale delle cellule death e in particolare la SPS-BM qui presentato, può essere applicato a ricerche di altri modelli del mouse incorporano transgeni che hanno un impatto sulla neurogenesi adulta. Ulteriori applicazioni possono comprendere lo studio di agenti farmacologici e misurare il loro impatto sulla separazione modello DG e spaziale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neurogenesi adulta, e la possibilità della sua manipolazione attraverso l'inibizione di NF-kB nei neuroni, e la sua riattivazione in seguito con doxiciclina, offre un affascinante sistema di indagini neuroni nel cervello adulto, così come in neuronale de-e ri-generazione . La bellezza di questo sistema è che NF-kB via di segnalazione inibizione dei neuroni non solo si traduce in cambiamenti nella morte neuronale, proliferazione progenitore e migrazione, i cambiamenti strutturali e anatomiche gravi, ma anche nei d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Angela Kralemann-Köhler per un eccellente supporto tecnico. Il lavoro sperimentale qui descritta è stata eseguita nel nostro laboratorio ed è stata sostenuta da sovvenzioni del Consiglio di ricerca tedesco (DFG) a CK e BK e una borsa di studio del ministero tedesco della Ricerca e dell'Istruzione (BMBF) per BK.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
References
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