שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי
Summary
שיטות למניפולציה והניתוח של neurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר NF-κB תלוי מתוארות. פרוטוקול מפורט מוצג לבדיקה משוננת gyrus תלוי התנהגותי (שמכונה במבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי) לחקירת תוצאה קוגניטיבית בעכברים. טכניקה זו צריכה גם לעזור לאפשר חקירות בהגדרות ניסיוניות אחרות.
Abstract
ההיפוקמפוס ממלא תפקיד מרכזי בהיווצרות והגיבוש של זכרונות אפיזודי, ובהתמצאות במרחב. מבחינה היסטורית, ההיפוקמפוס המבוגר נצפה כאזור אנטומי מאוד סטטי של המוח היונקים. עם זאת, הממצאים אחרונים הראו כי הרכס משוננת של ההיפוקמפוס הוא אזור של פלסטיות עצומה במבוגרים, הכולל לא רק שינויים של מעגלים עצביים קיימים, אלא גם neurogenesis למבוגרים. פלסטיות זה מוסדרת על ידי רשתות תעתיק מורכבות, שבו גורם שעתוק NF-κB משחק תפקיד בולט. ללמוד ולטפל neurogenesis למבוגרים, מודל עכבר מהונדס לעיכוב עצבי מוח קדמי ספציפי של פעילות NF-κB ניתן להשתמש.
במחקר זה, שיטות מתוארות לניתוח נוירוגנזה NF-κB תלויה, לרבות היבטיה המבניים, אפופטוזיס העצבי ושגשוגם מולידם, ומשמעות קוגניטיבית, אשרשעות היו דווקא העריכה באמצעות gyrus משוננת (DG) תלוי מבחן התנהגות, מבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי (SPS-BM). פרוטוקול SPS-BM יכול להיות פשוט מותאם לשימוש עם מודלים של בעלי חיים מהונדסים אחרים שנועדו להעריך את השפעתם של גנים מסוימים בneurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר. יתר על כן, SPS-BM יכול לשמש בהגדרות ניסיוניות אחרות שמטרתם לחקור ומניפולצית למידת DG תלויה, למשל, באמצעות סוכנים תרופתיים.
Introduction
אונטולוגית, ההיפוקמפוס הוא אחד המבנים העתיקים ביותר במוח אנטומיים הידועים. הוא אחראי על משימות מורכבות מגוונות, כגון פונקציות מרכזיות בוויסות של זיכרון לטווח ארוך, התמצאות במרחב, ועל היווצרות וגיבוש של הזיכרון, בהתאמה. מבחינה אנטומית, ההיפוקמפוס מורכב משכבות פירמידה תא (pyramidale שכבה) כוללים cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, וCA4) האזורים וgyrus משוננת (dentatus gyrus), המכיל תאי גרגיר וכמה אבות עצביים באזור subgranular . תאי גרגיר להקרין לכיוון אזור CA3 באמצעות הסיבים שנקרא אזובי (האקסונים של תאי גרגיר).
עד סוף המאה שעברה, היה האמין המוח של היונקים הבוגרים להיות איבר סטטי חסר פלסטיות ונוירוגנזה סלולריות. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, כמות הולכת וגדלה של עדויות מראה בבירור neurogenesis למבוגרים המתרחשים בלפחותשני אזורים במוח, אזור subventricular (SVZ) ואזור subgranular של ההיפוקמפוס.
המחקרים הקודמים שלנו, ואלה של קבוצות אחרות, הראו כי גורם שעתוק NF-κB הוא אחד הרגולטורים המולקולריים החיוניים של neurogenesis למבוגרים, ושתוצאות דה הרגולציה שלה בפגמים חמורים מבניים בהיפוקמפוס וליקויים קוגניטיביים 1-6. NF-κB הוא השם הגנרי של גורם שעתוק מושרה מורכב משילובים שונים dimeric של חמש יחידות משנה-DNA מחייבת: p50, P52, c-Rel, RelB, וp65 (רלה), יש להם את שלוש האחרונים שבם תחומים transactivation. בתוך המוח, הצורה נפוצה ביותר נמצאת בציטופלסמה היא heterodimer של p50 וp65, אשר נשמר בצורה פעילה על ידי מעכב של kappa B (IκB), חלבונים.
ללמוד ולתפעל ישירות נוירוגנזה מונעת-NF-κB, אנו משתמשים במודלי עכבר מהונדסים כדי לאפשר עיכוב פשוט של כל subun NF-κBשלה, במיוחד במוח הקדמי 7 (ראה איור 1). לצורך כך, אנו חוצים גידלו-השורות הבאות מהונדסים עכבר, IκB / – ו-/tTA. IκB / המהונדס – הקו נוצר באמצעות מוטציה שלילית טרנס דומיננטי של NF-κB-המעכב IκBa (סופר מדכא IκBa-Aa1) 8. בניגוד לIκBα wild-type, יש IκBα–1AA שתי שאריות סרין מוטציה לalanines (V32 וV36), אשר מעכב את זירחון והשפלה proteasomal הבא של המעכב. לביטוי נוירון הספציפי מוח קדמי של IκBa–1AA-transgene, IκB / – עכברים הכליאו עם עכברי מחסה קינאז בסידן calmodulin תלוי IIα (CAMKIIα), אמרגן שיכול להיות מונע על ידי טרנס activator טטרציקלין (TTA) 9.
יש עכברים עקום החוצה p65 פנוטיפ הקטלני עוברי, בשל אפופטוזיס כבד המסיבי 10, ולכן הגישה המוצגת כאן מספקת שיטה אלגנטיתלחוקר את התפקיד של NF-κB בלידה וneurogenesis למבוגרים.
מבחן ההתנהגות הקלאסי ללמוד למידה וזיכרון המרחביים שתואר ב1980s על ידי ריצ'רד מוריס, מבחן המכונה המים מבוך מוריס (MWM) 11. במי מבוך פתוח בתחום זה, בעלי חיים ילמדו לברוח ממים אטומים על גבי פלטפורמה מוסתרת מבוססת על רמזי התמצאות ובמיוחד מבוך. גרסה יבשה של MWM היא המבוך שנקרא ברנס (BM) 12. בדיקה זו עושה שימוש בצלחת עגולה עם 20 חורים עגולים מסודרים בגבול של צלחת, עם חור אחד מוגדר כתיבת בריחה, ורמזים נוסף מבוך חזותיים לאורינטציה. שני פרדיגמות הניסוי מסתמכות על הטיסה הנגרמת על ידי מכרסמים `s סלידה למים, או שטחים פתוחים, מוארים ההתנהגות. בשני המבחנים יאפשר חקירה של התמצאות במרחב, וביצועי זיכרון הקשורים. למרות ההיפוקמפוס ממלא תפקיד בכלל וחיוני להיווצרות הזיכרון המרחבי, r בהיפוקמפוסegions המעורב להשתנות בהתאם למבחן המוחל. הזיכרון נבדק בBM נובע מפעילות עצבית בין קליפת מוח enthorinal (EC) ונוירונים פירמידליים ממוקמים באזור CA1-של ההיפוקמפוס בלי תרומה של 13-16 DG. בפרט, BM הקלאסי נשען בעיקר על ניווט באמצעות מסלול monosynaptic temporo-ammonic מEC III לCA1 לEC V. חשוב לציין, DG הוא מעורב באופן מכריע בהכרה שנקרא מרחבית דפוס 17, מה שמרמז לא רק העיבוד של מידע חזותי ומרחבית, אלא גם את הפיכתו של ייצוג או זכרונות דומים לייצוגים שונים, nonoverlapping. משימה זו דורשת מעגל פונקציונלי תלת סינפטי מEC השני לDG לCA3 לCA1 ו-EC השישי, שלא ניתן לבדוק ב15 BM.
כדי לטפל באתגרים אלה, יש לנו המציאו SPS-BM כמבחן התנהגותי כדי לבדוק את הביצועים קוגניטיביים משוננת gyrus תלוי בשיתוף במיוחדבעלי החיים ntrol, ובמודל סופר המדכא IκB / TTA הבא עיכוב NF-κB. חשוב לציין, בניגוד לMWM או BM, SPS-BM יכול לחשוף גירעונות התנהגותיים עדינים הנובעים מירידת הערך של נוירוגנזה. מאז מרחבית דפוס ההפרדה היא תלויה אך ורק על מעגל פונקציונלי בין EC השני וDG וCA3 וCA1 ו-EC VI, המבחן הזה הוא רגיש מאוד לשינויים אפשריים בנוירוגנזה, שינויים של מסלול אזובי סיבים או שינויים של הומאוסטזיס רקמה בתוך DG.
מבחינה טכנית, ההגדרה של הבדיקה שלנו מבוססת על המחקר של Clelland et al., שבו דפוס ההפרדה המרחבית נבדק באמצעות מבוך 8 זרוע עץ זרוע הרדיאלית (RAM) 19. בהגדרה שונה שלנו, הוחלפו שמונה זרועות על ידי שבעה בתי אוכל צהובים זהים. לסיכום, השיטות שמוצגים כאן, ובכלל זה ניתוח (DCX +)-להביע תאי doublecortin בתוך ההיפוקמפוס, תחזיות אזובי סיבים, דה תאים עצביתATH ובמיוחד SPS-BM שהוצג כאן, יכול להיות מיושם על חקירות של דגמי עכבר אחרים המשלבים transgenes שיש להם השפעה על neurogenesis למבוגרים. יישומים נוספים עשויים לכלול את המחקר של סוכנים תרופתיים ומדידת ההשפעה שלהם על הפרדת דפוס DG ומרחבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
neurogenesis למבוגרים, ואת האפשרות של המניפולציה שלה באמצעות עיכוב של NF-κB בתאי עצב, ומאוחר יותר מחדש שלה באמצעות דוקסיציקלין, מציע מערכת מרתקת לחקירות לנוירונים יילוד במוח הבוגר, כמו גם לדה ודור מחדש עצבי . היופי של השיטה הזו הוא שעיכוב מסלול איתות NF-κB בנוירונים תוצאות לא ר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאנג'לה Kralemann-קוהלר לתמיכה טכנית מצוינת. עבודה ניסויית שתוארה במסמך זה בוצעה במעבדה שלנו ונתמך על ידי מענקים של מועצת המחקר הגרמנית (DFG) לCK וBK ומענק של המשרד הגרמני למחקר וחינוך (BMBF) לBK.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
References
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. . Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
