Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht
Summary
Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ausgelöst werden. Aktuelle Protokolle Autophagozytose in vivo im Rahmen des CLP-induzierten Sepsis beurteilt werden hier vorgestellt: Ein Protokoll für die Messung unter Verwendung Autophagozytose (GFP)-LC3 Mäuse und ein Protokoll für die Messung Autophagosom Bildung durch Elektronenmikroskopie.
Abstract
Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode, die Sepsis verursacht polymikrobiellen induziert werden. Hier wird ein Protokoll vorgesehen, um Sepsis unterschiedlichen Schweregrades in Mäusen zu induzieren mit der CLP Technik. Autophagie ist ein Grundgewebereaktion auf Stress und Krankheitserreger Invasion. Zwei Stromprotokollen zu Autophagozytose in vivo im Rahmen des experimentellen Sepsis beurteilen sind auch hier vorgestellt. (I) Transgene Mäuse, grün fluoreszierendes Protein (GFP)-LC3-Fusionsprotein exprimieren, werden CLP unterworfen. Lokalisierten Erhöhung der GFP-Signal (puncta), entweder durch immunhistochemische Assays getestet oder konfokalen kann verwendet werden, um verbesserte Bildung Autophagosom erfassen und somit verändert Aktivierung der Autophagie werden. (II) Verbesserte autophagischen Vakuole (Autophagosom)-Bildung pro Einheit Gewebebereich (als Marker der Autophagie Stimulation) kann mit Hilfe der Elektronenmikroskopie quantifiziert werden. Das Studium der Autophagie Antworten auf Sepsis ist eine kritische Layoutonent Verständnis der Mechanismen, durch die Gewebe reagieren auf eine Infektion. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztendlich zum Verständnis der Pathogenese der Sepsis, die ein großes Problem in der Intensivmedizin stellt beitragen.
Introduction
Sepsis, eine systemische entzündliche Reaktion auf eine Infektion, eine der häufigsten Todesursachen bei kritisch-kranken Patienten ein. Intra-abdominale Infektionen, die oft polymikrobiellen Sepsis führen, entfallen 20% der Sepsisfälle, die erhebliche Sterblichkeit von bis zu 60% 2 haben. Sepsis-assoziierte Mortalität resultiert im Wesentlichen aus Multi-Organ-Dysfunktion mit anschließender Organversagen 3,4. Weitere Untersuchungen in den Pathomechanismus dieser Erkrankung ist dringend erforderlich, um die Entwicklung neuer und wirksamere Therapien zu fördern.
Die Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Modellierung von Sepsis in vivo. Wie der Blinddarm ist voll von Bakterien, seiner Punktion ergibt polymikrobiellen Peritonitis, Translokation von Bakterien in das Blut (Bakteriämie), septischer Schock, Multi-Organ-Dysfunktion und schließlich Tod 5. Es ist allgemein anerkannt, daß CLP reflektiert klinischenRealität genauer als frühere Verfahren, wie Injektion von Endotoxin oder gereinigten Bakterien in Nagetieren Somit CLP wird als Goldstandard (wenn auch nicht ohne Einschränkungen) 6 für die experimentelle Induktion und somit die Untersuchung der Pathogenese von Sepsis. In dieser Monographie, beschreiben wir Protokolle entwickelt, um zu beurteilen, ob pathogene Mechanismen der Sepsis sind Autophagie.
Autophagy eine evolutionär konservierte zelluläre Prozess erleichtert den Umsatz von beschädigten Proteinen und Organellen, wie Mitochondrien und spielt eine wichtige Rolle bei der Clearance von intrazellulären Pathogenen wie Bakterien 7,8. Während Autophagozytose sind cytosolische Proteine oder Organellen in die Doppelmembran-Vesikel gebunden genannt autophagosomes, die anschließend zu den Lysosomen zum Abbau 9 geliefert werden abgetrennt. Eine Reihe von Proteinen, wie den Säugerhomologen Autophagozytose-Genen (ATG) identifiziert,ursprünglich in der Hefe, die den Prozess der Autophagie regulieren identifiziert. Die Umwandlung von Mikrotubuli-assoziierten Protein-1-Leichtketten-3B (LC3B) (Homolog Atg8) aus LC3B-I (freie Form) zu LC3B-II (Phosphatidylethanolamin-konjugierter Form) stellt einen wichtigen Schritt in Autophagosom Bildung 9. Autophagische Dysfunktion ist mit dem Altern und der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen 10 zugeordnet. Darüber hinaus wirkt sich die Autophagie angeborenen und erworbenen Immunität, wie Antigen-Präsentation, Lymphozytenentwicklung und Zytokin-Sekretion von Immunzellen 8. So scheint es sinnvoll, dass die Autophagie könnte auch in der systemischen Entzündungsreaktion auf eine Infektion (zB bei Sepsis) eine Rolle spielen.
Bisher mehrere Verfahren beschrieben worden, um die Rolle der Autophagie in Gewebeverletzung in vivo zu beurteilen. Dazu gehören der Einsatz der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP)-LC3 exprimierenden Mäusen und die Quantifizierung der AutoPhagosomen in Gewebe durch Elektronenmikroskopie (Diese beiden Verfahren werden in dieser Monographie beschrieben). Weitere Methoden sind die Quantifizierung von Autophagie-Protein-Expression in Gewebehomogenaten, und die Analyse der Autophagie Fluss (wie an anderer Stelle beschrieben), 11-13. Das Ziel dieser Überprüfung ist es, für die Beurteilung der aktuellen Protokolle Autophagie in vivo im Rahmen der experimentellen Sepsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der große Vorteil des CLP ist, dass es erlaubt Forschern, Sepsis unterschiedlicher Schweregrade (dh von Low-bis Mid-und High-grade) zu untersuchen. Der Schweregrad der induzierten Sepsis wird durch die Länge der Blinddarm ligiert (was die wichtigste Determinante) betroffen, die Größe der Nadel für die Punktion verwendet, und die Anzahl der Löcher 15 durchgeführt. Darüber hinaus kann die Maus-Stamm und Geschlecht von der Schwere der Sepsis beeinflussen; mehrere Stämme sind anfälliger als and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
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