Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı
Summary
Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. CLP kaynaklı sepsis bağlamında in vivo Otofaji değerlendirmek için mevcut protokoller burada sunulmuştur: (GFP)-LC3 fareler kullanılarak Otofaji ölçülmesi için bir protokol ve elektron mikroskobu ile autophagosome oluşumunu ölçmek için bir protokolü.
Abstract
Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme polimikrobiyaldir sepsis neden olur (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. Burada, bir protokol CLP tekniği kullanılarak farelerde değişen şiddetinin sepsis uyarılması için sağlanmaktadır. Autophagy stres ve patojen istilası için temel bir doku tepkisi olduğu. Deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirmek için iki Otofaji mevcut protokoller de burada sunulmaktadır. (I), yeşil flüoresan protein (GFP)-LC3 füzyon proteini ifade eden transjenik farenin CLP tabi tutulur. GFP sinyali (puncta) lokalize geliştirme, imünohistokimyasal veya konfokal tahlilleri yoluyla analiz edilmiş olarak, gelişmiş autophagosome oluşumunu algılamak ve, otofaji yolu bu nedenle, değiştirilmiş aktivasyon için kullanılabilir. (Autophagy stimülasyon bir göstergesi olarak) birim doku alanı başına (II) Geliştirilmiş otofajik küçük boşluk (autophagosome) formasyonu elektron mikroskobu kullanılarak belirlenebilir. Sepsise otofajik yanıtların çalışma kritik bir compdokular enfeksiyona yanıt hangi mekanizmaları anlamada onent. Bu alandaki araştırma bulguları sonuçta kritik bakım tıpta önemli bir problem teşkil etmektedir sepsis patogenezi, anlamaya yönelik katkıda bulunabilir.
Introduction
Sepsis, enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt, eleştirmenlerce hastalarda 1 ölüm önde gelen nedeni temsil eder. Genellikle polimikrobiyaldir sepsise yol açan karın içi enfeksiyonlar,% 60 kadar 2 önemli mortaliteye sahip olan, sepsis vakalarının% 20 için hesap. Sepsis-ilişkili mortalite öncelikle sonraki organ yetmezliği 3,4 ile çoklu organ disfonksiyonu kaynaklanır. Bu hastalığın patojenik mekanizması içine ek araştırma acil, yeni ve daha etkili tedavilerin gelişmesini teşvik etmek gereklidir.
Çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemi in vivo modelleme sepsis için yaygın olarak kullanılan bir işlemdir. Sonuçta çekum bakteri dolu olarak, polimikrobial peritonit onun ponksiyon sonuçları, kan (bakteriyemi) içine bakteri translokasyonu, septik şok, çoklu organ yetmezliği ve ölüm 5. Genellikle CLP klinik yansıttığı kabul edilmektedirdaha doğru gibi kemirgenler içine endotoksin ya da saflaştırılmış bakterilerin enjeksiyonu gibi daha önceki tekniklere göre daha gerçeklik Böylece, CLP sepsis patogenezinde soruşturma dolayısıyla, deneysel indüksiyon için 6 (değil sınırlamalar olmadan da olsa) altın standart kabul edilir ve. Bu monografi, biz sepsis patojenik mekanizmaları Otofaji dahil olup olmadığını değerlendirmek için tasarlanmış protokolleri açıklar.
Autophagy, evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücre işlem olup, hasar görmüş proteinlerin ve mitokondri gibi organel ciro kolaylaştırır ve bakteriler de dahil olmak üzere hücre içi 7,8 patojenlerin temizlenmesinde önemli bir rol oynar. Otofaji sırasında sitosolik proteinler organeller ya da sonradan bozulması 9 lizozomlara teslim edilir autophagosomes olarak adlandırılan iki membran-sınırlayıcı kabarcıklar içine tecrit edilir. Bir dizi protein autophagy-ilişkili genlerin memeli homologları (ATG) olarak tespit edilmiştir,ilk Otofaji süreci düzenleyen maya içinde tespit edilmiştir. LC3B-I (serbest form) için mikrotübül-ilişkili protein 1 hafif zincir 3B (LC3B) (Atg8 of homologu) dönüşümü (fosfatidiletanolamin-konjuge form)-II LC3B için autophagosome oluşumu 9 önemli bir adımı temsil eder. Otofajik fonksiyon bozukluğu, yaşlanma ve kanser ve nörodejeneratif bozukluklar 10 de dahil olmak üzere, insan hastalıkları ile ilişkilidir. Ayrıca, otofaji bağışıklık hücreleri 8 antijen sunumu, lenfosit geliştirme ve sitokin sekresyonu gibi doğal ve adaptif bağışıklık etkiler. Böylece, otofaji da enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt (yani sepsis) bir rol oynayabileceğini söyledi makul görünüyor.
Bugüne kadar çeşitli yöntemler in vivo doku hasarında Otofaji rolünü değerlendirmek için tarif edilmiştir. Bu yeşil floresan protein (GFP)-ifade LC3 farelerin kullanımı ve oto miktarının dahilelektron mikroskobu ile dokuda phagosomes (bu iki yöntem bu monografi açıklanmıştır). Ilave yöntemler doku homojenatlarında otofajik protein ifadesinin miktarının, ve (başka bir yerde tarif edildiği gibi) otofajik akı analizi 11-13 içerir. Bu incelemenin amacı, deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirilmesi için mevcut Otofaji protokolleri sağlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLP büyük avantajı araştırmacıların (düşük-orta ve yüksek sınıftan itibaren yani) farklı ağırlıktaki sepsis araştırmak için izin vermesidir. Neden olduğu sepsis şiddeti bağlanmış çekum uzunluğu (en önemli belirleyicisi) etkilenir, delme için kullanılan iğne boyutu ve deliklerin sayısı 15, gerçekleştirilir. Buna ek olarak, fare suşu ve cinsiyet sepsis şiddetine etkileyebilir; çeşitli suşlarının diğerlerine göre daha hassastır ve genellikle erkek kadınlarda…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
