Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi
Summary
Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP). Attuali protocolli per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi CLP-indotta sono presentati qui: Un protocollo per misurare autofagia utilizzando topi (GFP)-LC3, e un protocollo per misurare formazione dell'autofagosoma mediante microscopia elettronica.
Abstract
Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP), che causa sepsi polimicrobica. Qui, un protocollo è realizzato per indurre sepsi di gravità variabile nei topi usando la tecnica CLP. L'autofagia è una risposta tessuto fondamentale per lo stress e patogeno invasione. Due protocolli attuali per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi sperimentale sono anche presentati qui. (I) topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde proteina (GFP)-LC3 di fusione sono sottoposti a CLP. Valorizzazione localizzata di segnale GFP (puncta), come saggiata mediante analisi immunoistochimica o confocale, può essere utilizzato per rilevare la formazione dell'autofagosoma maggiore e, quindi, l'attivazione alterata della via autofagia. (II) rafforzata vacuole autophagic (dell'autofagosoma) formazione per area di tessuto dell'unità (come marcatore di stimolazione dell'autofagia) può essere quantificato usando la microscopia elettronica. Lo studio delle risposte autofagiche a sepsi è un comp criticoonent di comprendere i meccanismi attraverso i quali i tessuti rispondono alle infezioni. Risultati della ricerca in questo settore possono infine contribuire a comprendere la patogenesi della sepsi, che rappresenta un problema importante in terapia intensiva.
Introduction
La sepsi, la risposta infiammatoria sistemica all'infezione, rappresenta una delle principali cause di morte nei pazienti criticamente malati-1. Infezioni intra-addominali, spesso portano alla sepsi polimicrobica, rappresentano il 20% dei casi di sepsi, che hanno sostanziale la mortalità fino al 60% 2. La mortalità associata alla sepsi risulta principalmente dalla disfunzione multi-organo con conseguente insufficienza d'organo 3,4. Ulteriori indagini nel meccanismo patogenetico di questa malattia è urgentemente necessaria per promuovere lo sviluppo di nuove e più efficaci terapie.
Il metodo di legatura del cieco e puntura (CLP) è una procedura comunemente utilizzata per la modellazione sepsi in vivo. Come il cieco è piena di batteri, i risultati di puntura in peritonite polimicrobica, traslocazione di batteri nel sangue (batteriemia), shock settico, disfunzione multi-organo e, infine, morte 5. E 'generalmente accettato che CLP riflette clinicarealtà più accurato rispetto alle tecniche precedenti, come l'iniezione di endotossina o batteri anche depurati nei roditori, Così, CLP è considerato il gold standard (non senza limitazioni) 6 per l'induzione sperimentale e, quindi, l'indagine della patogenesi della sepsi. In questa monografia, descriviamo protocolli progettati per valutare se i meccanismi patogenetici di sepsi sono autofagia.
L'autofagia, un processo cellulare evolutivamente conservata, facilita il turnover delle proteine e organelli come i mitocondri danneggiati e svolge un ruolo importante nella clearance dei patogeni intracellulari, tra cui i batteri 7,8. Durante l'autofagia, proteine citosoliche o organuli sono sequestrate in vescicole di membrana matrimoniali sono nominate autophagosomes, che vengono successivamente consegnati ai lisosomi per la degradazione 9. Un certo numero di proteine sono stati identificati come gli omologhi mammiferi di geni autophagy correlati (ATG),originariamente identificato nel lievito, che regolano il processo di autofagia. La conversione dei microtubuli proteina associata-1 catena leggera 3B (LC3B) (omologo di Atg8) dal LC3B-I (forma libera) per LC3B-II (forma fosfatidiletanolamina coniugata) rappresenta un passo importante nella formazione dell'autofagosoma 9. La disfunzione autophagic è associato con l'invecchiamento e le malattie umane, tra cui il cancro e le malattie neurodegenerative 10. Inoltre, l'autofagia colpisce l'immunità innata e adattativa quali la presentazione dell'antigene, lo sviluppo dei linfociti e la secrezione di citochine da parte delle cellule immunitarie 8. Pertanto, sembra ragionevole che autofagia potrebbe anche svolgere un ruolo nella risposta infiammatoria sistemica all'infezione (cioè nella sepsi).
Fino ad oggi diversi metodi sono stati descritti per valutare il ruolo dell'autofagia in lesioni dei tessuti in vivo. Questi includono l'uso di proteina fluorescente verde (GFP)-LC3 topi che esprimono e la quantificazione delle autophagosomes nel tessuto mediante microscopia elettronica (questi due metodi sono descritti in questa monografia). Altri metodi includono la quantificazione dell'espressione della proteina autophagic in omogenati di tessuto, e l'analisi del flusso autofagica (come descritto altrove) 11-13. L'obiettivo di questa revisione è quello di fornire attuali protocolli per valutare l'autofagia in vivo nel contesto della sepsi sperimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il principale vantaggio di CLP è che permette ai ricercatori di indagare sepsi di diversi livelli di gravità (cioè da basso a medio e alto grado). Gravità della sepsi indotta è influenzata dalla lunghezza del cieco ligato (che il determinante più importante), la dimensione di ago usato per puntura e il numero di fori eseguiti 15. Inoltre, il ceppo di topi e di genere possono avere un impatto sulla gravità della sepsi; diversi ceppi sono più sensibili di altri e maschi sono generalmente più s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
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