La ligadura y punción cecal inducida por sepsis como un modelo para estudiar la autofagia en ratones
Summary
La sepsis experimental puede ser inducida en ratones usando el método (CLP) ligadura y punción cecal. Los protocolos actuales para evaluar la autofagia in vivo en el contexto de la sepsis inducida por CLP se presentan aquí: Un protocolo para la medición de la autofagia utilizando ratones (GFP)-LC3, y de un protocolo para la medición de la formación de autofagosoma por microscopía electrónica.
Abstract
La sepsis experimental puede ser inducida en ratones usando el método (CLP), que causa la sepsis polimicrobiana ligadura y punción cecal. Aquí, se proporciona un protocolo para inducir la sepsis de diversa gravedad en ratones utilizando la técnica de CLP. La autofagia es una respuesta de los tejidos fundamentales para el estrés y la invasión de patógenos. Dos protocolos actuales para evaluar la autofagia in vivo en el contexto de la sepsis experimental también se presentan aquí. (I) Los ratones transgénicos que expresan la proteína de fluorescencia verde proteína de fusión (GFP)-LC3 son sometidos a CLP. Mejora localizada de la señal de GFP (puntos lagrimales), tal como se ensayaron, ya sea por ensayos inmunohistoquímicos o confocal, se puede utilizar para detectar la formación de autofagosoma mejorada y, por lo tanto, la activación alterada de la vía de la autofagia. (II) mejorada vacuola de autofagia (autofagosoma) formación por unidad de área de tejido (como un marcador de la estimulación de la autofagia) puede cuantificarse utilizando microscopía electrónica. El estudio de las respuestas autofágicas a sepsis es un borrador críticoonent de la comprensión de los mecanismos por los que los tejidos respondan a la infección. Resultados de la investigación en esta área pueden contribuir en última instancia, hacia la comprensión de la patogénesis de la sepsis, lo que representa un problema importante en la medicina de cuidados críticos.
Introduction
La sepsis, una respuesta inflamatoria sistémica a la infección, representa la principal causa de muerte en los pacientes críticamente enfermos 1. Las infecciones intra-abdominales, a menudo conduce a la sepsis polimicrobiana, representan el 20% de los casos de sepsis, que tienen una mortalidad considerable de hasta un 60% 2. La mortalidad asociada a la sepsis se debe principalmente a la disfunción multiorgánica con insuficiencia orgánica posterior 3,4. Investigación adicional en el mecanismo patogénico de esta enfermedad es una necesidad urgente de promover el desarrollo de terapias novedosas y más eficaces.
El método de ligadura cecal y punción (CLP) es un procedimiento comúnmente utilizado para el modelado de la sepsis en vivo. Como el ciego está llena de bacterias, sus resultados de punción en la peritonitis polimicrobianas, la translocación de bacterias en la sangre (bacteriemia), shock séptico, disfunción de múltiples órganos y, en última instancia, la muerte 5. Se acepta en general que refleja CLP clínicarealidad con mayor precisión que las técnicas anteriores, tales como la inyección de endotoxina o bacterias incluso purificados en roedores, Por lo tanto, CLP se considera el estándar de oro (aunque no sin limitaciones) 6 para la inducción experimental y, por lo tanto, la investigación de la patogénesis de la sepsis. En esta monografía, se describen los protocolos diseñados para evaluar si los mecanismos patogénicos de la sepsis incluyen la autofagia.
La autofagia, un proceso celular conservado evolutivamente, facilita la facturación de proteínas y orgánulos tales como mitocondrias dañadas y juega un papel importante en el aclaramiento de los patógenos intracelulares, incluyendo bacterias 7,8. Durante la autofagia, proteínas u orgánulos citosólicas son secuestradas en vesículas unidas a la membrana dobles llamados autofagosomas, que posteriormente se entregan a los lisosomas para degradación 9. Un número de proteínas se han identificado como los homólogos de mamíferos de genes relacionados con la autofagia (ATG),originalmente identificado en la levadura, que regulan el proceso de autofagia. La conversión de la proteína asociada a microtúbulos-1 de la cadena ligera 3B (LC3B) (homólogo de Atg8) de-I LC3B (forma libre) a LC3B-II (forma-fosfatidiletanolamina conjugado) representa un paso importante en la formación autofagosoma 9. Disfunción autofagia se asocia con el envejecimiento y enfermedades humanas incluyendo cáncer y trastornos neurodegenerativos 10. Por otra parte, la autofagia afecta la inmunidad innata y adaptativa, tales como la presentación de antígenos, el desarrollo de linfocitos y la secreción de citoquinas por las células inmunes 8. Por lo tanto, parece razonable que la autofagia también podría desempeñar un papel en la respuesta inflamatoria sistémica a la infección (es decir, en la sepsis).
Hasta la fecha se han descrito varios métodos para evaluar el papel de la autofagia en la lesión tisular in vivo. Estos incluyen el uso de ratones que expresan la proteína de fluorescencia verde (GFP)-LC3 y la cuantificación de Autofagosomas en el tejido por microscopía electrónica (estos dos métodos se describen en esta monografía). Métodos adicionales incluyen la cuantificación de la expresión de la proteína de la autofagia en homogeneizados de tejido, y el análisis de flujo de autofagia (como se describe en otra parte) 11-13. El objetivo de esta revisión es proporcionar los protocolos actuales para la evaluación de la autofagia en vivo en el contexto de la sepsis experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
La principal ventaja de CLP es que permite a los investigadores estudiar la sepsis de diferentes niveles de gravedad (es decir, de bajo a medio y de alto grado). Gravedad de la sepsis inducida se ve afectada por la longitud del intestino ciego ligado (que el determinante más importante), el tamaño de la aguja utilizada para la punción y el número de agujeros realizados 15. Además, la cepa de ratón y el género pueden influir en la gravedad de la sepsis; varias cepas son más susceptibles que ot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
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