Cecal ligation और चूहे में भोजी अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में पूति पंचर प्रेरित
Summary
प्रायोगिक पूति cecal बंधाव और पंचर (सीएलपी) विधि का उपयोग चूहों में प्रेरित किया जा सकता है. CLP प्रेरित पूति के संदर्भ में vivo में भोजी का आकलन करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत कर रहे हैं: (GFP) LC3 चूहों का उपयोग भोजी को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा autophagosome गठन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल.
Abstract
प्रायोगिक पूति cecal बंधाव और पंचर polymicrobial पूति का कारण बनता है जो (सीएलपी) की विधि का उपयोग करते हुए चूहों में प्रेरित किया जा सकता है. इधर, एक प्रोटोकॉल CLP तकनीक का उपयोग चूहों में तीव्रता बदलती के पूति के लिए प्रेरित करने के लिए प्रदान की जाती है. भोजी तनाव और रोगज़नक़ आक्रमण करने के लिए एक मौलिक ऊतक प्रतिक्रिया है. प्रयोगात्मक पूति के संदर्भ में vivo में भोजी का आकलन करने के लिए दो मौजूदा प्रोटोकॉल भी यहां प्रस्तुत कर रहे हैं. (मैं) हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) LC3 संलयन प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों CLP के अधीन हैं. GFP संकेत (puncta) के स्थानीयकृत वृद्धि, immunohistochemical या confocal assays के द्वारा या तो assayed के रूप में, बढ़ाया autophagosome गठन का पता लगाने और, भोजी मार्ग के प्रकार, बदल सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (भोजी उत्तेजना के एक मार्कर के रूप में) इकाई ऊतक क्षेत्र के प्रति (द्वितीय) बढ़ी autophagic रिक्तिका (autophagosome) के गठन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. पूति के लिए autophagic प्रतिक्रियाओं का अध्ययन एक महत्वपूर्ण COMP हैऊतकों संक्रमण का जवाब है जिसके द्वारा तंत्र को समझने की onent. इस क्षेत्र में अनुसंधान के निष्कर्षों अंततः क्रिटिकल केयर मेडिसिन में एक बड़ी समस्या का प्रतिनिधित्व करता है जो पूति के रोगजनन, समझने की दिशा में योगदान कर सकते हैं.
Introduction
पूति, संक्रमण के लिए एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया, गंभीर रूप से बीमार रोगियों 1 में मौत का एक प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है. अक्सर polymicrobial पूति के लिए अग्रणी अंतर पेट में संक्रमण,, 60% तक 2 की पर्याप्त मृत्यु दर है, जो पूति मामलों के 20% के लिए खाते. पूति से जुड़े मृत्यु दर मुख्य रूप से बाद के अंग विफलता 3,4 साथ कई अंगों में शिथिलता का परिणाम है. इस रोग के रोगजनक तंत्र में अतिरिक्त जांच की तत्काल उपन्यास और अधिक प्रभावी उपचार के विकास को बढ़ावा देने की जरूरत है.
cecal बंधाव और पंचर (सीएलपी) विधि vivo में मॉडलिंग पूति के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रक्रिया है. अंततः अंधान्त्र बैक्टीरिया से भरा है, polymicrobial पेरिटोनिटिस में अपनी पंचर परिणाम, रक्त (bacteremia) में बैक्टीरिया के स्थानान्तरण, सेप्टिक सदमे, बहु अंग शिथिलता और, मौत 5. यह आम तौर पर CLP नैदानिक दर्शाता है कि स्वीकार कर लिया हैअधिक सही ऐसे कृन्तकों में endotoxin या यहां तक कि शुद्ध बैक्टीरिया के इंजेक्शन के रूप में पिछले तकनीकों, से वास्तविकता, इस प्रकार, चिली पूति के रोगजनन की जांच, इसलिए, प्रयोगात्मक शामिल होने के लिए 6 (सीमाओं के बिना नहीं यद्यपि) सोने के मानक माना जाता है और कर रहा है. इस मोनोग्राफ, हम पूति के रोगजनक तंत्र भोजी शामिल है कि क्या आकलन तैयार प्रोटोकॉल का वर्णन.
भोजी, एक evolutionarily संरक्षित सेलुलर प्रक्रिया, क्षतिग्रस्त प्रोटीन और ऐसे mitochondria के रूप में organelles के कारोबार की सुविधा और बैक्टीरिया 7,8 सहित intracellular रोगज़नक़ों की निकासी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. भोजी के दौरान, साइटोसोलिक प्रोटीन या organelles बाद में गिरावट 9 लाइसोसोम के लिए दिया जाता है, जो autophagosomes बुलाया डबल झिल्ली ही सीमित पुटिका, में तनहा कर रहे हैं. प्रोटीन की एक संख्या भोजी से संबंधित जीन की स्तनधारी homologues (ATG) के रूप में पहचान की गई है,मूल रूप से भोजी की प्रक्रिया को विनियमित जो खमीर में पहचान की. LC3B मैं (स्वतंत्र रूप) से microtubule जुड़े प्रोटीन -1 प्रकाश श्रृंखला 3 बी (LC3B) (Atg8 की सजात) के रूपांतरण (phosphatidylethanolamine संयुग्मित फार्म) द्वितीय LC3B को autophagosome गठन 9 में एक बड़ा कदम का प्रतिनिधित्व करता है. Autophagic शिथिलता उम्र बढ़ने और कैंसर और neurodegenerative विकारों 10 सहित मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, भोजी ऐसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं 8 से प्रतिजन प्रस्तुति, लिम्फोसाइट विकास और cytokine स्राव के रूप में सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली प्रभावित करता है. इस प्रकार, यह भोजी भी संक्रमण के लिए प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया (यानी पूति में) में एक भूमिका निभा सकता है कि उचित लगता है.
तिथि करने के लिए कई तरीके vivo में ऊतक चोट में भोजी की भूमिका का आकलन करने के लिए वर्णित किया गया है. ये हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) LC3 व्यक्त चूहों का इस्तेमाल करते हैं और ऑटो की मात्रा का ठहराव शामिलइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा ऊतकों में phagosomes (इन दो तरीकों इस मोनोग्राफ में वर्णित किया गया है). अतिरिक्त तरीकों के ऊतक homogenates में autophagic प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव, और (कहीं वर्णित) autophagic प्रवाह का विश्लेषण 11-13 में शामिल हैं. इस समीक्षा का लक्ष्य प्रयोगात्मक पूति के संदर्भ में vivo में भोजी का आकलन करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल प्रदान करना है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएलपी के प्रमुख लाभ यह शोधकर्ताओं (कम करने के लिए मध्य और उच्च ग्रेड से आईई) विभिन्न कठोर अनुशासन की पूति जांच करने के लिए अनुमति देता है. प्रेरित पूति की गंभीरता ligated अंधान्त्र की लम्बाई (जो सबसे महत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
