Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l'IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Summary

Les cellules dendritiques (DCs) sécrètent de l'IL-1β en réponse à la reconnaissance de la purine TLR8 synthétique, R848, suivie de l'activation de l'inflammasome NLRP3 avec nigéricine, par conséquent, l'IL-1β peut être utilisé pour mesurer l'activité de inflammasome NLRP3. Coloration des cytokines intracellulaires, immuno, et ELISA sont utilisés pour mesurer avec précision NLRP3 inflammasome amorçage et l'activation par l'IL-1β expression.

Abstract

Les processus inflammatoires résultant de la sécrétion de l'interleukine (IL) -1 cytokines de la famille par les cellules immunitaires conduisent à l'inflammation locale ou systémique, le remodelage et la réparation tissulaire, et le contrôle virologique ^{1, 2.} L'interleukine-1β est un élément essentiel de la réponse immunitaire innée et contribue à éliminer les pathogènes envahisseurs, tout en empêchant l'établissement d'une infection persistante ^5.1.

Inflammasomes sont la plate-forme de signalisation clé pour l'activation de l'enzyme de conversion de l'interleukine 1 (ICE ou la caspase-1). L'inflammasome NLRP3 nécessite au moins deux signaux dans les PED pour provoquer l'IL-1β sécrétion ^6. Pro-IL-1β expression de la protéine est limitée dans les cellules au repos; par conséquent, un signal d'amorçage est nécessaire pour l'IL-1β transcription et l'expression de la protéine. Un second signal détecté par les résultats NLRP3 dans la formation de la protéine multi-NLRP3 inflammasome. La capacité des cellules dendritiques à responsabilitéd pour les signaux nécessaires pour l'IL-1β sécrétion peut être testée en utilisant une purine synthétique, R848, qui est détecté par TLR8 dans monocyte humain dérivé des cellules dendritiques (moDCs) aux cellules de premier, suivie de l'activation de l'inflammasome NLRP3 avec la toxine bactérienne et ionophore de potassium, la nigéricine.

Monocytes PED dérivés sont facilement produites dans la culture et fournissent beaucoup plus de cellules que des DC myéloïdes humaines purifiées. La méthode présentée ici se distingue d'autres dosages de inflammasome en ce qu 'il utilise en humaine in vitro, à la place de la souris dérivée, DCs permettant ainsi l'étude de l'inflammasome dans la maladie humaine et l'infection.

Introduction

Activation du système immunitaire inné est nécessaire pour orienter les réponses immunitaires adaptatives cours de l'infection, la maladie et la vaccination ^7. Les cellules dendritiques sont le plus puissant antigène présentant des cellules du système immunitaire inné; ils sont spécialisés pour l'absorption des antigènes, la migration vers les ganglions lymphatiques, et l'activation des naïfs CD4 ⁺ et CD8 ⁺ cytolytiques des cellules T ^8-10. Pour activer la détection rapide des agents pathogènes du système immunitaire inné utilise de nombreuses lignées germinales codé reconnaissance de formes récepteurs (PRR) qui reconnaissent pathogènes conservé motifs dérivés ou des marqueurs d'accueil dérivé de stress cellulaire et les dommages. Toll récepteurs (TLR) sont liés à la membrane reconnaissance de formes récepteurs qui reconnaissent certains pathogène phagocyté extracellulaire des motifs associés moléculaires (PAMP) et danger motifs moléculaires associés (atténue). En revanche clin d'œil comme récepteurs (NLR) sont cytosolique et de répondre à un large éventail de PAMP et Damps. Nod comme récepteurs représenter une deuxième ligne de défense contre les agents pathogènes qui échappent surface de la cellule et PRR d'endocytose. L'interaction de l'agent pathogène dérivé, ou «danger» associée, facteurs avec TLR et NLR ligands conduit à un état ​​de maturation des DC entraînant une augmentation de l'interaction DC avec d'autres cellules immunitaires et la promotion des cellules T et l'activation naturelle des cellules tueuses ^11.

L'interleukine-1β est un élément essentiel de la défense de l'hôte contre l'infection. Dès la reconnaissance d'un micro-organisme, la cytokine hautement pro-inflammatoire, l'IL-1β, est sécrétée et fonctionne comme un appât de chimio et activateur des cellules immunitaires innées et adaptatives. In vivo d'IL-1β est en grande partie responsable de la réponse de phase aiguë, y compris la fièvre et de cytokines inflammatoires synthèse ^12.

La plupart des NLR contiennent un domaine de répétition riche en C terminal de la leucine qui est pensé à fonctionner dans le ligand de détection, un domaine de liaison de nucleotide central (NACHT) qui est important pour NLRP3 oligomérisation, et un domaine effecteur borne N (PYD dans NLRP3) qui médie la transduction du signal de cibles en aval à travers des interactions de protéines de protéines. La protéine NLRP3 définit complexe inflammasome le plus intensément étudié. Cette protéine est un membre de la famille NLR et a la capacité de former un complexe moléculaire de la protéine composée de plusieurs NLRP3, PYCARD la protéine adaptatrice (également connu sous le nom ASC) et ICE. Lors de l'activation inflammasome PYCARD lie à NLRP3 domaines N terminaux et recrute ICE via l'activation des caspases et le domaine de recrutement (carte) domaines. L'interleukine-1 'enzyme de conversion est d'abord généré en tant que zymogène contenant un motif CARD à son extrémité N-terminale. Les résultats de la formation inflammasome dans la mise deux molécules ICE suffisamment proche pour induire leur activation autocatalytique. Le complexe de l'inflammasome est nécessaire pour activer ICE lui permettant ainsi de convertir la pro-IL-1β cytoplasmique de mûrir cytokine.

Le succès de la sécrétion d'IL-1β dans les PED nécessite la détection de deux signaux de danger différentes et indépendantes. Tout d'abord, la détection de TLR PAMP, amortit, ou la signalisation des cytokines (TNFa ou l'IL-1β) provoque une régulation positive de l'expression de protéines pro-IL-1β cytoplasmique. Un second souvent différente, signal, est nécessaire pour la formation du complexe inflammasome amont de la CIE maturation. Un peu inflammasome stimulant signaux comprennent des toxines bactériennes des pores de la membrane formant (comme nigéricine), lysosomales perturber cristaux (tels que des cristaux d'urate monosodique, MSU), et l'ATP extracellulaire. Le mécanisme en amont menant à NLRP3 activation inflammasome par ces divers activateurs n'est pas claire. Les études portant sur ​​la signalisation en amont de la formation inflammasome propose que les événements intracellulaires, comme l'induction d'une hypokaliémie ou d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) activent indirectement l'inflammasome ^13-28.

Parmi les différents activateurs viraux de l'inflammasome NLRP3 est la grippe, qui fournit des bOTH le signal primaire et secondaire nécessaire pour la sécrétion d'IL-1β ^{3, 29-33.} En utilisant des modèles NLRP3 huitièmes de finale de la souris, il a été constaté que l'IL-1β la sécrétion dans les PED est NLRP3 dépendante ^32. En outre, les souris knock-out NLRP3 attiré moins de leucocytes vers le site de l'infection et ont connu une mortalité plus élevée ^{2, 5.} Deux articles récents suggèrent un mécanisme pour l'activation de l'inflammasome NLRP3 cours de l'infection par le virus de la grippe; en premier lieu, par la reconnaissance d'amorce d'ARN viral par TLR7 ou TLR8 (en fonction de l'expression de TLR de la cellule de répondre) ou par détection de bactéries commensales par d'autres TLR pour induire l'expression pro-IL-1β cytoplasmique, suivi d'un second signal, l'activation de NLRP3 formation inflammasome par la protéine virale de canal ionique M2 sur le réseau trans de Golgi ^{33, 34.} Dans la dernière étape, le déclenchement de l'inflammasome NLRP3 est accompli par les perturbations de l'ionique intracellulaire <em> milieu conduisant à la production de ROS, qui est, tout simplement, détectée par NLPR3 comme un signal pour former l'inflammasome. Cependant, le mécanisme précis de l'inflammasome amont de l'activation de l'activité ICE lors de l'infection grippale demeure encore incertain.

Ce travail décrit une technique précieuse pour l'étude de l'inflammasome NLRP3 dans moDCs humaines qui peut être utilisé comme une base pour une enquête plus approfondie de la voie sous-jacent DC sur la base d'IL-1β sécrétion en réponse à TLR8 ligature avec R848 suivie de l'activation de l'inflammasome par un puits activateur connu de NLRP3, nigéricine. Des variantes de ce procédé peuvent être utilisés avec d'autres types de cellules, y compris, mais sans s'y limiter: les monocytes, les macrophages, les autres sous-ensembles à courant continu, et les cellules épithéliales.

Protocol

Déclaration d'éthique: les échantillons de recherche sont obtenus et stockés pour la recherche avec le consentement des donateurs. Tous les échantillons doivent être codées ou rendues anonymes avant de les utiliser. Ce protocole suit les lignes directrices de notre comité d'examen institutionnel. 1. Différenciation des droits de périphériques monocytes sanguins dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes. Remarque: couches leucocytaire…

Representative Results

Ces techniques mesurent TLR8 amorçage avec R848. Coloration des cytokines intracellulaires pour la pro-IL-1β permet de microscopie et AAAF lectures du CD14 – CD11c + moDCs. Les deux techniques peuvent être quantifiés par rapport à une non apprêté, ou de repos, de contrôle de cellules ainsi que d'un contrôle isotypique (figures 1 et 2). Pour cent des cellules pro-IL-1β + coloration est multiplié par la moyenne géométrique de cette population de fournir l&…

Discussion

Cytokines inflammatoires font partie intégrante de pilotage de la réponse immunitaire innée et adaptative pour combattre l'infection virale. IL-1β sécrétée a été démontré que l'augmentation lors de l'infection d'influenza ^{3, 43, 44.} Les mécanismes précis par lequel ces cytokines sont traitées en réponse à la reconnaissance du virus dans les cellules dendritiques humaines sont pas entièrement comprises. Kits d'isolement DC myéloïdes sont coûteux et fastidieux. kits d&#39…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707