Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Summary

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Abstract

Processos inflamatórios resultantes da secreção de interleucina (IL) -1 citocinas família de células do sistema imunológico levar à inflamação local ou sistêmica, remodelação e reparação tecidual e controle virológico ^{1, 2.} Interleucina-1β é um elemento essencial da resposta imune inata e contribui para eliminar agentes patogénicos invasores, evitando a criação de uma infecção persistente ^1-5.

Inflammasomes são a plataforma de sinalização fundamental para a ativação da enzima conversora de interleucina 1 (ICE ou Caspase-1). O inflammasome NLRP3 requer, pelo menos, dois sinais em DCs para provocar a secreção de ^IL-6 1β. A expressão da proteína pro-IL-1β é limitado em células em repouso; Por conseguinte, um sinal de iniciação é necessária para a transcrição IL-1β e a expressão da proteína. Um segundo sinal detectado pelo Nlrp3 resultados na formação do NLRP3 inflammasome multi-proteína. A capacidade das células dendríticas que respond para os sinais requeridos para a secreção de IL-1β pode ser testado utilizando uma purina sintético, R848, que é detectada por TLR8 em monócitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) de células principais, seguido de activação da inflammasome NLRP3 com a toxina bacteriana e ionóforo de potássio, nigericina.

DCs derivadas de monócitos, são facilmente produzidas em cultura e fornecer um número significativamente maior do que as células purificadas DCs mielóides humanos. O método aqui apresentado difere de outros ensaios inflammasome em que ele usa em humanos in vitro, em vez de ratinho derivada, permitindo assim DCs para o estudo da inflammasome na doença humana e infecção.

Introduction

A ativação do sistema imune inato é necessário para orientar as respostas imunes adaptativas durante a infecção, doença e vacinação ^7. As células dendríticas são o antigénio mais potente que apresenta as células do sistema imune inato; eles são especializados para a absorção de antígenos, a migração para os gânglios linfáticos, e ativação de ingênuo CD4 ⁺ e as células T CD8 ⁺ citolítica ^8-10. Para permitir a detecção de patógenos rápida do sistema imune inato utiliza inúmeros receptores de reconhecimento padrão germinativas codificado (PRR) que reconhecem patógenos conservada motivos derivados ou host derivado marcadores de estresse celular e danos. Toll like receptors (TLRs) são receptores de reconhecimento padrão membrana ligada que reconhecem determinado patógeno fagocitada extracelular padrões associados moleculares (PAMPs) e padrões moleculares de perigo associado (amortece). Ao aceno contraste como receptores (NLRs) são citosólica e responder a uma gama diversificada de PAMPs e DAMPs. Nod like receptors reapresentar uma segunda linha de defesa contra patógenos que escapam da superfície celular e PRRs endocíticas. A interação do patógeno derivada, ou "perigo" associado, fatores com TLR e NLR ligantes leva a um estado de maturação DC resultando em aumento da interação DC com outras células do sistema imunológico e na promoção de células T e ativação das células natural killer ^11.

Interleucina-1β é um componente crucial da defesa do hospedeiro contra a infecção. Mediante o reconhecimento de um microrganismo, a citoquina altamente pró-inflamatória IL-1β, é segregada e funciona como um atractivo químico e activador de células imune inata e adaptativa. In vivo de IL-1β é em grande parte responsável pela resposta de fase aguda, incluindo febre e citocinas inflamatórias síntese ^12.

A maioria dos NLRs conter uma leucina do terminal C rico domínio de repetição que é pensado para funcionar na detecção do ligando, um domínio de ligação de nucleótido central (NACHT) que é important para NLRP3 oligomerização e um domínio efetor terminal de N (PYD em NLRP3) que medeia a transdução de sinal para alvos a jusante através de interações proteína proteína. A proteína NLRP3 define o complexo inflammasome mais intensamente estudado. Esta proteína é um membro da família NLR e tem a capacidade de formar um complexo de proteína molecular de vários compostos de NLRP3, o PYCARD proteína adaptadora (também conhecido como ASC), e ICE. Após a ativação inflammasome PYCARD liga a domínios terminais NLRP3 N e recruta ICE via ativação da caspase e domínio de recrutamento (cartão) domínios. A interleucina-1 da enzima de conversão é inicialmente gerado como um zimogénio que contém um motivo CARTÃO na sua extremidade N-terminal. Resultados de formação inflammasome em trazer duas moléculas ICE suficientemente perto para induzir sua ativação autocatalítica. O complexo inflammasome é necessário para activação de ICE, assim permitindo que a converter citoplasmática pró-IL-1β para amadurecer citocina.

Secreção de IL sucedida-1β em DCs requer detecção de dois sinais diferentes e independentes de perigo. Primeiro, TLR detecção de PAMPs, DAMPs, ou sinalização de citocinas (TNF ou IL-1β) provoca uma regulação positiva da expressão citoplasmática de proteínas pró-IL-1β. Uma segunda, muitas vezes diferentes, o sinal é necessário para a formação do complexo inflammasome a montante de maturação ICE. Alguns inflammasome estimulando sinais incluem poros da membrana bacteriana formando toxinas (como nigericina), lisossomais interromper cristais (tais como cristais de urato monossódico, MSU) e ATP extracelular. O mecanismo montante levando a ativação NLRP3 inflammasome por esses diversos ativadores não é clara. Estudos investigando sinalizando a montante da formação inflammasome propõe que os eventos intracelulares, tais como a indução da hipocalemia ou espécies reativas de oxigênio (ROS) indiretamente ativar o inflammasome ^13-28.

Entre os diferentes activadores virais do inflammasome NLRP3 é gripe, que fornece both o sinal primário e secundário necessário para a secreção de IL-1β ^{3, 29-33.} Usando modelos de mouse NLRP3 knockout verificou-se que a secreção de IL-1β em DCs é NLRP3 dependente ^32. Além disso, ratinhos knockout Nlrp3 atraído menor número de leucócitos para o local da infecção e experimentaram maior mortalidade ^{2, 5.} Dois artigos recentes sugerem um mecanismo para a ativação inflammasome NLRP3 durante a infecção pelo vírus Influenza; em primeiro lugar, por meio de priming reconhecimento de ARN viral por TLR7 TLR8 ou (dependendo expressão TLR da célula responder) ou através de detecção de bactérias comensais por outro TLR para induzir a expressão citoplasmática pró-IL-1β, seguido por um segundo sinal, a activação de NLRP3 formação inflammasome pela proteína de canal iônico viral M2 na rede de Golgi trans ^{33, 34.} No último passo, o desencadeamento de inflammasome NLRP3 é realizado por perturbação do intracelular iónico <in> meio que conduz a produção de ROS, que é, simplesmente, detectada por NLPR3 como um sinal de modo a formar o inflammasome. No entanto, o mecanismo preciso de inflammasome montante activação de actividade da ICE durante a infecção da gripe ainda permanece incerto.

Este trabalho descreve uma técnica valiosa para o estudo da inflammasome NLRP3 em moDCs humanos que pode ser usado como uma base para uma investigação mais aprofundada da via subjacente DC baseado secreção de IL-1β em resposta a TLR8 ligadura com R848 seguido pela ativação do inflammasome por um bem activador conhecido de NLRP3, nigericina. Variações deste método pode ser usado com outros tipos de células, incluindo, mas não limitados a: monócitos, macrófagos, outros subconjuntos DC, e células epiteliais.

Protocol

Declaração de Ética: Amostras de pesquisa são obtidos e armazenados para pesquisa com o consentimento dos doadores. Todas as amostras devem ser codificadas ou anónimos, antes da utilização. Este protocolo segue as diretrizes do nosso Conselho de Revisão Institucional. 1. Diferenciação de monócitos do sangue periférico em células dendríticas derivadas de monócitos. Nota: cremes leucocitários humanos servir como fonte de células do sangue periférico…

Representative Results

Estas técnicas medir TLR8 priming com R848. Coloração citocina intracelular para pró-IL-1β permite a microscopia e FACS leituras de CD14 – CD11c + moDCs. Ambas as técnicas podem ser quantificados em relação a um não carregadas, ou de descanso, controlo de células, bem como um controlo do isotipo (Figuras 1 e 2). Percentagem de células pró-IL-1β + coloração é multiplicado pela média geométrica da população para fornecer a intensidade de fluorescência …

Discussion

As citocinas inflamatórias são essenciais na condução da resposta imune inata e adaptativa para combater a infecção viral. Secretado IL-1β tem sido demonstrado que o aumento durante a infecção da gripe ^{3, 43, 44.} Os mecanismos exactos pelos quais essas citocinas são processados, em resposta ao reconhecimento viral em células dendríticas humanas não são completamente compreendidos. Mielóides kits de isolamento DC são caros e demorados. Kits de isolamento e FAC classificação pode involuntariam…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707