Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos
Summary
Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β.
Abstract
Los procesos inflamatorios resultantes de la secreción de interleucina (IL) -1 citocinas de la familia de las células inmunes conducen a la inflamación local o sistémica, remodelación y reparación de tejidos, y el control virológico 1, 2. La interleucina-1β es un elemento esencial de la respuesta inmune innata y contribuye a eliminar los patógenos invasores al tiempo que evita el establecimiento de la infección persistente 1-5.
Inflamosomas son la plataforma de señalización clave para la activación de la interleucina 1 de la enzima convertidora (ICE o caspasa-1). El inflamasoma NLRP3 requiere al menos dos señales en los países en desarrollo para hacer que la secreción de IL-1β 6. Pro-IL-1β expresión de la proteína se limita en las células en reposo; por lo tanto, se requiere una señal de cebado para la transcripción de IL-1β y expresión de la proteína. Una segunda señal detectada por los resultados NLRP3 en la formación de la inflamasoma NLRP3 multi-proteína. La capacidad de las células dendríticas para responsabilidadd para las señales requeridas para la secreción de IL-1β se puede probar usando una purina sintética, R848, que es detectado por TLR8 en monocitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) a las células principales, seguido por la activación de la inflamasoma NLRP3 con la toxina bacteriana y ionóforo de potasio, nigericina.
Monocitos DCs derivadas son fácilmente producidos en la cultura y proporcionan significativamente más células que purificados mieloide países en desarrollo humano. El método presentado aquí se diferencia de otros ensayos inflamasoma en que se utiliza en humanos in vitro, en lugar de ratón derivada, permitiendo así que los países en desarrollo para el estudio de la inflamasoma en la enfermedad humana y la infección.
Introduction
Se requiere Activación del sistema inmune innato para dirigir la respuesta inmune adaptativa durante la infección, la enfermedad y la vacunación 7. Las células dendríticas son el antígeno más potente que presenta células del sistema inmune innato; están especializados para la captación de antígenos, la migración a los ganglios linfáticos, y la activación de citolítica CD8 + T-células 8-10 ingenuo CD4 + y. Para habilitar la detección de patógenos rápida del sistema inmune innato utiliza numerosos receptores de reconocimiento de patrón de la línea germinal codificada (PRR) que reconocen patógenos motivos conservados derivados o marcadores de acogida derivado de estrés celular y el daño. Receptores tipo Toll (TLRs) son los receptores de reconocimiento de patrones unidas a la membrana que reconocen ciertos patógeno fagocitado extracelular patrones asociados molecular (PAMP) y los patrones moleculares de peligro asociado (apaga). Por el contrario guiño como receptores (NLRs) son citosólicas y responder a una amplia gama de PAMP y DAMPS. Nod como receptores representar una segunda línea de defensa contra los patógenos que evaden superficie celular y PRRs endocítica. La interacción de los patógenos derivada, o "peligro" asociada, factores con TLR y NLR ligandos conduce a un estado de maduración de las DC que resulta en una mayor interacción DC con otras células inmunes y la promoción de las células T y activación de las células asesinas naturales 11.
La interleucina-1β es un componente crucial de la defensa del huésped contra la infección. A partir del reconocimiento de un microorganismo, la citoquina altamente proinflamatorias, IL-1β, se secreta y funciona como un atrayente de quimioterapia y activador de las células inmunitarias innatas y adaptativas. In vivo de IL-1β es en gran parte responsable de la respuesta de fase aguda incluyendo fiebre y citoquina inflamatoria síntesis 12.
La mayoría de NLRs contienen un dominio rico en leucina repetir el terminal C que se cree que funcionar en la detección de ligando, un dominio de unión de nucleótidos central (NACHT) que es importante para la oligomerización NLRP3, y un dominio efector terminal de N (PYD en NLRP3) que media la transducción de señales a través de objetivos de abajo interacciones proteína-proteína. La proteína NLRP3 define el complejo más intensamente estudiado inflamasoma. Esta proteína es un miembro de la familia de NLR y tiene la capacidad para formar un complejo de proteínas múltiples molecular compuesta de NLRP3, la PYCARD proteína adaptadora (también conocido como ASC), y el ICE. Después de la activación inflamasoma PYCARD une al terminal de dominios NLRP3 N y recluta a través de ICE (tarjeta) dominios de activación de caspasas y contratación de dominio. La interleucina-1 de la enzima convertidora se genera inicialmente como un zimógeno que contiene un motivo TARJETA en su extremo N-terminal. Resultados de formación inflamasoma en la unión de dos moléculas de ICE suficientemente cerca para inducir su activación autocatalítica. El complejo inflamasoma es necesaria para la activación de ICE por lo tanto lo que le permite convertir citoplásmica Pro-IL-1β para madurar citoquina.
El éxito de la secreción de la IL-1β en los países en desarrollo requiere la detección de dos señales de peligro distintas e independientes. En primer lugar, TLR detección de PAMP, DAMPS, o la señalización de citoquinas (TNF o IL-1β) causa una regulación positiva de la expresión de la proteína citoplasmática pro-IL-1β. Se requiere una segunda frecuencia diferente, señal, para la formación de complejos inflamasoma aguas arriba de la maduración del ICE. Algunos inflamasoma estimular señales incluyen toxinas de los poros de la membrana bacteriana que forman (como nigericina), lisosomales interrumpir cristales (tales como cristales de urato monosódico, MSU) y ATP extracelular. El mecanismo ascendente que conduce a la activación NLRP3 inflamasoma por estos diversos activadores no está claro. Estudios de investigación de aguas arriba de señalización de la formación de inflamasoma propone que los eventos intracelulares, tales como la inducción de la hipopotasemia o especies reactivas de oxígeno (ROS) activan indirectamente la inflamasoma 13-28.
Entre los diferentes activadores virales del inflamasoma NLRP3 es la influenza, que proporciona banto la señal primaria y secundaria requerida para la secreción de IL-1β 3, 29-33. Utilizando modelos knockout NLRP3 ratón se encontró que la secreción de IL-1β en los países en desarrollo es NLRP3 dependiente 32. Además, los ratones knockout NLRP3 atraídos menos leucocitos al sitio de la infección y experimentaron una mayor mortalidad 2, 5. Dos estudios recientes sugieren un mecanismo para la activación inflamasoma NLRP3 durante la infección por el virus de la influenza; primero, el cebado a través del reconocimiento de ARN viral por TLR7 o TLR8 (dependiendo de TLR expresión de la célula de responder) o a través de sensores de las bacterias comensales por otro TLR para inducir la expresión en favor de la IL-1β citoplásmica, seguido por una segunda señal, la activación de NLRP3 formación inflamasoma por la proteína viral del canal iónico M2 en la red trans del Golgi 33, 34. En este último paso, la activación del inflamasoma NLRP3 se logra mediante la alteración de la iónica intracelular <em> entorno que conduce a la producción de ROS, que es, simplemente, detectada por NLPR3 como una señal para formar el inflamasoma. Sin embargo, el mecanismo exacto de la activación aguas arriba inflamasoma de la actividad de ICE durante la infección por influenza sigue siendo poco clara.
Este trabajo describe una técnica valiosa para el estudio de la inflamasoma NLRP3 en moDCs humanos que se puede utilizar como una base para la investigación adicional de la vía subyacente DC basado secreción de IL-1β en respuesta a TLR8 ligadura con R848 seguido por la activación de la inflamasoma por un pozo conocido activador de la NLRP3, nigericina. Las variaciones de este método se puede utilizar con otros tipos de células incluyendo, pero no limitados a: los monocitos, macrófagos, otros subconjuntos de DC, y células epiteliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las citocinas inflamatorias son integrales en la dirección de la respuesta inmune innata y adaptativa para combatir la infección viral. Secretada de IL-1β se ha demostrado que aumenta durante la infección por influenza 3, 43, 44. Los mecanismos precisos por los que estas citoquinas se procesan en respuesta al reconocimiento viral en células dendríticas humanas no se entienden completamente. Kits de aislamiento DC mieloides son costosos y requerir mucho tiempo. Kits de aislamiento y clasificación FAC pu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., y Meagan O'Brien, MD por su apoyo y comentarios. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y completado con fondos del NIH subvenciones Ruth L. Kirschstein Premios Nacionales del Servicio de Investigación para individuales becas predoctorales (F31) para promover la diversidad en la Investigación en Salud, (AI089030) y SR1 (AI081848 ).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12-well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96-well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12 % polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| α-CD11c | BD | 555392 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol – 4L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P-36931 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
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