Aktivering och Mätning av NLRP3 inflamma aktivitet med användning av IL-1β i human monocyt-härledda dendritiska celler

Summary

Dendritiska celler (DC) utsöndrar IL-1β som svar på TLR8 erkännande av syntetisk purin, R848, följt av NLRP3 inflamma aktivering med nigericin därför IL-1β kan användas för att mäta NLRP3 inflamma aktivitet. Intracellulär cytokin färgning, immunoblotting, och ELISA används för att noggrant mäta NLRP3 inflamma priming och aktivering via IL-1β uttryck.

Abstract

Inflammatoriska processer till följd av utsöndring av interleukin (IL) -1 familje cytokiner av immunceller leder till lokal eller systemisk inflammation, vävnadsombildning och reparationer, och virologisk kontroll ^{1, 2.} Interleukin-1β är en viktig del av det medfödda immunförsvaret och bidrar till att eliminera invaderande patogener samtidigt förhindra etableringen av ihållande infektion ^1-5.

Inflammasomes är nyckeln signaleringsplattform för aktivering av interleukin-1-omvandlande enzym (ICE eller Caspase-1). NLRP3 inflamma kräver minst två signaler i DCs att orsaka IL-1β sekre ^6. Pro-IL-1β-proteinuttryck är begränsat i vilande celler; därför en priming signal krävs för IL-1β-transkription och proteinuttryck. En andra signal som avkänns av NLRP3 resulterar i bildningen av den av flera protein NLRP3 inflamma. Förmågan hos dendritceller att ansvarigtd till de signaler som krävs för IL-1β-utsöndring kan testas med användning av en syntetisk purin, R848, som avkänns av TLR8 i human monocyt-härledda dendritiska celler (moDCs) att prima celler, följt av aktivering av NLRP3 inflamma med bakteriellt toxin och kalium jonofor, nigericin.

Härstammar från monocyter DCs lätt produceras i kultur och ger betydligt fler celler än renade human myeloid DC. Den metod som presenteras här skiljer sig från andra inflamma analyser genom att den använder in vitro människa, i stället för mus härledd, DCs vilket möjliggör studier av inflamma i human sjukdom och infektion.

Introduction

Aktivering av medfödda immunsystemet krävs för att styra adaptiva immunsvaret vid infektion, sjukdom och vaccination ^7. Dendritiska celler är de mest potenta antigenpresenterande celler av det medfödda immunsystemet; De är specialiserade för upptag av antigener, migration till lymfkörtlar, och aktivering av naiva CD4 ⁺ och cytolytiska CD8 ⁺ T-celler ^8-10. För att möjliggöra snabb upptäckt patogen det medfödda immunsystemet utnyttjar många könsceller kodad mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) som känner igen bevarade patogen härrör motiv eller värd härrör markörer för cell stress och skador. Toll liknande receptorer (TLRs) är membranbundna mönsterigenkännings receptorer som känner igen vissa cellulära fagocytiserade patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) och fara molekylära mönster (dämpas). Däremot nicka liknande receptorer (NLRs) är cytosoliskt och svara på en rad olika PAMPs och dämpar. Nicka liknande receptorer relägga fram en andra försvarslinje mot patogener som undgå cellytan och endocytiska PRRs. Interaktionen av patogenen härleds, eller "fara" associerat, faktorer med TLR och NLR ligander leder till ett tillstånd av DC-mognad leder till ökad DC interaktion med andra immunceller och främjande av T-cell-och naturliga mördarcellaktivering ^11.

Interleukin-1β är en avgörande komponent i infektionsförsvaret. Vid erkännande av en mikroorganism, den starkt proinflammatoriska cytokiner, IL-1β, utsöndras och fungerar som en cellgifter lockmedel och aktivator av medfödda och adaptiva immunceller. In vivo IL-1β är till stor del ansvarig för den akuta fasen svaret inklusive feber och inflammatoriska cytokiner syntes ^12.

De flesta NLRs innehålla en C-terminal leucin-rika upprepningsdomän som är tänkt att fungera i ligand-avkänning, en central nukleo-bindningsdomän (NACHT) som är important för NLRP3 oligomerisering, och en N terminal effector domain (PYD i NLRP3) som medierar signaltransduktion till mål nedströms genom protein-proteininteraktioner. NLRP3 proteinet definierar mest intensivt studerade inflamma komplex. Detta protein är en medlem av NLR familjen och har förmågan att bilda en multi molekylproteinkomplex bestående av NLRP3, adapterprotein PYCARD (även känd som ASC) och is. Vid inflamma aktivering PYCARD binder till NLRP3 N terminalområden och rekryterar ICE via kaspasaktivering och rekryteringsdomän (CARD) domäner. Interleukin-1-omvandlande enzym initialt genererad som en zymogen innehållande en CARD-motivet vid dess N-terminal. Inflammabildning leder föra två ICE molekyler tillräckligt nära för att framkalla deras autokatalytisk aktivering. Det inflamma komplex är nödvändigt för att aktivera ICE vilket gör det möjligt att omvandla cytoplasmatisk pro-IL-1β att mogna cytokin.

Framgångsrik sekretion av IL-1β i utvecklingsländer kräver avkänning av två olika och oberoende varningssignaler. Först TLR avkänning av PAMPs, dämpar, eller cytokin signalering (TNF eller IL-1β) orsakar en uppreglering av cytoplasma pro-IL-1β proteinuttryck. En andra, ofta olika, signalen krävs för inflammakomplexbildning uppströms om ICE mognad. Några inflamma stimulerande signaler inkluderar bakteriella membran porbildande toxiner (t.ex. nigericin), lysosomala störa kristaller (t.ex. mono uratkristaller, MSU) och extracellulärt ATP. Uppströms mekanism som leder till NLRP3 inflamma aktivering av dessa olika aktivatorer är oklart. Studier som undersöker signalerings uppströms av inflammabildning föreslår att intracellulära händelser, såsom induktion av hypokalemi eller reaktiva syreradikaler (ROS) indirekt aktivera inflamma ^13-28.

Bland de olika virus aktivatorer av NLRP3 inflamma är influensa, vilket ger bÖvr primär och sekundär signal som krävs för IL-1β sekre ^{3, 29-33.} Använda mus NLRP3 knockout modeller konstaterades det att IL-1β-utsöndring i DCs är NLRP3 beroende ^32. Dessutom NLRP3 knockoutmöss lockade färre leukocyter till platsen för infektion och haft en högre dödlighet ^{2, 5.} Två nya tidningarna tyder på en mekanism för NLRP3 inflamma aktivering under influensa virusinfektion; första, primning genom erkännande av viralt RNA genom TLR7 eller TLR8 (beroende på TLR expression av den svarande cell) eller genom avkänning av bakteriefloran genom annan TLRs att inducera cytoplasmatisk pro-IL-1β uttryck, följd av en andra signal, aktivering av NLRP3 inflammabildning genom viral jonkanalsprotein M2 på den trans-Golgi nätverket ^{33, 34.} I det senare steget, utlösning av NLRP3 inflamma åstadkommes genom störning av det intracellulära jonisk <em> miljö som leder till ROS produktion, vilket är, helt enkelt, kände av NLPR3 som en signal för att bilda inflammasome. Emellertid förblir den exakta mekanismen för inflamma aktivering uppströms om ICE-aktivitet under influensainfektion fortfarande oklart.

Detta arbete beskriver en teknik värdefullt för att studera NLRP3 inflamma i mänskliga moDCs som kan användas som en grund för vidare utredning av banan underliggande DC baserat IL-1β sekretion som svar på TLR8 ligation med R848 följt av aktivering av inflamma genom en väl känd aktivator av NLRP3, nigericin. Variationer av denna metod kan användas med andra celltyper, inklusive, men inte begränsat till: monocyter, makrofager, andra DC-undergrupper, och epitelceller.

Protocol

Etik Uttalande: Forskningsprov erhålls och lagras för forskning med givarnas samtycke. Alla prover bör kodas eller anonymiseras före användning. Detta protokoll följer riktlinjerna i vår Institutional Review Board. 1. Differentiering av humana perifera blod Monocyter in Monocyte härledda dendritiska celler. Obs: Mänskliga buffy coats tjäna som källa till humana perifera blodceller (PBMC) och erhölls från New York Blood Center (New York, NY). Blodgivare…

Representative Results

Dessa tekniker mäter TLR8 priming med R848. Intracellulär cytokin färgning för pro-IL-1β tillåter mikroskopi och FACS avläsning från CD14 – CD11c + moDCs. Båda teknikerna kan kvantifieras i förhållande till en icke primade, eller vila, cellkontroll liksom en isotyp kontroll (fig. 1 och 2). Procent av pro-IL-1β + färgningsceller multipliceras med den geometriska symmetri av denna population för att åstadkomma medianfluorescensintensitet (MFI). MFI är jämf…

Discussion

Inflammatoriska cytokiner är integrerad i styrningen av medfödda och adaptiva immunförsvaret att bekämpa virusinfektion. Utsöndrad IL-1β har visats öka under influensainfektion ^{3, 43, 44.} De exakta mekanismerna genom vilka dessa cytokiner bearbetas som svar på viral erkännande i humana dendritiska celler är inte helt klarlagda. Myeloid DC isolering kit är dyrt och tidskrävande. Isolation kit och FAC sortering kan oavsiktligt stress eller aktivera cellerna. Dessutom finns det ofta otillräcklig mä…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707