JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo's

Published: July 07, 2014
doi:
10.3791/51328
, ,
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science,University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology,Vesalius Research Center, VIB

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

Hoge niveaus van reactieve zuurstof species (ROS) kan een verandering van cellulaire redox toestand naar oxidatieve stress situatie veroorzaken. Deze situatie veroorzaakt oxidatie van moleculen (lipiden, DNA, eiwit) en leidt tot celdood. Oxidatieve stress ook invloed op de progressie van verscheidene pathologische aandoeningen zoals diabetes, retinopathieën, neurodegeneratie, en kanker. Derhalve is het belangrijk om instrumenten te definiëren oxidatieve stress condities te bestuderen niet alleen op het niveau van individuele cellen, maar ook in de context van hele organismen. Hier beschouwen we de zebravis embryo als een nuttig in vivo systeem om dergelijke studies uit te voeren en presenteren een protocol om in vivo oxidatieve stress te meten. Profiteren van fluorescerende probes ROS en zebravis transgene fluorescerende lijnen, ontwikkelen we twee verschillende methodes om oxidatieve stress te meten in vivo: i) een "hele embryo ROS-detectiemethode" voor de kwalitatieve meting van oxidatieve stress en ii) een "eencellige ROS detectiemethode "voor kwantitatieve metingen van oxidatieve stress. Hierin tonen we de werkzaamheid van deze procedure door het verhogen oxidatieve stress in weefsels door oxyderende agens en fysiologische of genetische methoden. Dit protocol is vatbaar voor voorwaartse genetische screens en het zal adres oorzaak-gevolg relaties van ROS helpen in diermodellen van oxidatieve stress-gerelateerde ziekten zoals neurologische aandoeningen en kanker.

Introduction

Oxidatieve stress is specifiek gedefinieerd als een aandoening die het gevolg van een onevenwichtige cellulaire redox toestand. Het complex redoxreacties die routinematig gebeuren in cellen bepalen de cellulaire redox-toestand. Redoxreacties omvatten alle chemische reacties die bestaan ​​uit de overdracht van elektronen tussen de atomen van biologische moleculen produceren reductie en oxidatie van moleculen (bijvoorbeeld redoxreacties). Deze reacties worden gekatalyseerd door elektronische sturing soorten (pro-oxidatieve deeltjes), die worden gekenmerkt door een extreme structurele instabiliteit en spontane activatie van onevenwichtige elektronen die uit met naburige biomoleculen. Deze onregelmatige reacties resulteren in DNA-schade, eiwit carboxylatie en vetverbranding, en uiteindelijk leiden tot celdood 1. Verhoogde niveaus van oxidatieve stress zijn geassocieerd met veroudering en de progressie van verschillende pathologische toestanden 2. Oxidatieve stress heeftgerapporteerd verantwoordelijk voor vasculaire veranderingen in diabetes en cardiovasculaire aandoeningen 3,4 te zijn. Het speelt ook een cruciale rol in neuronale degeneratie bij de ziekte van Alzheimer en Parkinson 5. Bovendien is oxidatieve stress is aangetoond als een kritieke factor in het bestuur van de progressie van kanker en metastatische gebeurtenissen 6,7. Bovendien kan ontsteking en immuunreacties en verdere steun oxidatieve stress 8.

In levende cellen, worden pro-oxidatieve deeltjes afkomstig uit zuurstof (ROS, reactieve zuurstofspecies) of stikstof (RNS, reactieve stikstof species). ROS zijn de hydroxylgroep, de superoxide anion (OH.) (O 2 -) en waterstofperoxide (H 2 O 2). De primaire RNS is stikstofoxide (NO.). Een reeks van secundaire reactieve species kunnen worden gegenereerd door spontane interactie between ROS en RNS of vrije metalen ionen 9. Bijvoorbeeld, het superoxide anion reageert met lachgas te peroxynitraat (ONOO -) vorm, terwijl H 2 O 2 reageren met Fe2 + genereert hydroxylradicalen. ROS en RNS, vanwege hun vermogen om te reageren met verschillende biomoleculen, worden beschouwd als een gevaarlijke bedreiging voor het onderhoud van de fysiologische redox toestand 10. Handhaving van de redox toestand cellen zijn uitgerust met een reeks ontgiftende anti-oxidant moleculen en enzymen. Het superoxide dismutase (SOD), katalase, glutathion peroxidase en Peroxiredoxins wezen vormen de anti-oxidant enzymatische-arsenaal dat cellulaire bescherming biedt tegen pro-oxidatieve soorten, waaronder H 2 O 2, OH en OONO -. 11. Ook anti-oxidant moleculen zoals vitamine C en E, polyfenolen en CoenzymeQ10 (CoQ10) zijn van cruciaal belang voor ROS en de gevaarlijke de lessenderivaten 12,13. Echter, een overmatige productie van ROS en RNS, of disfunctie in de anti-oxidant systeem, verschuift de cellulaire redox-toestand naar oxidatieve stress 14.

Naast hun negatieve connotatie, kan ROS verschillende fysiologische rol spelen in de cellen van verschillende oorsprong. Cellen normaal produceren ROS als signaalmoleculen te bemiddelen normale biologische gebeurtenissen zoals afweer en wondheling 15-17. Reactieve species worden gewoonlijk geproduceerd in cellen door intracellulaire enzymen zoals NOx (NADPH oxidase) en XO (xanthine oxidase) in reactie op signalering factoren, groeifactoren, en intracellulaire schommelingen van calcium 18,19. Er werd gemeld dat ROS differentieel kan moduleren de activiteit van belangrijke nucleaire factoren zoals p53 of cellulaire componenten zoals de ATM-kinase, de regulering van de respons op DNA-schade 20. Analoog ROS beïnvloeden sterk cellulaire signalering door te bemiddelen the oxidatie en inactivering van eiwit tyrosine fosfatasen (PTP's), die zijn gevestigd als kritische regulatoren van signaaltransductie 21. Bovendien proteomics gebaseerde methoden tonen dat RNS ook verantwoordelijk zijn voor specifieke proteïne modificaties en veranderingen van moleculaire signalering. RNS reageren met de cysteine ​​thiolgroepen te wijzigen in S-nitrothiols (SNO) en triggering moleculaire wegen gelijktijdig met pathologische, zoals ontsteking en auto-immuunziekten 22,23.

Aangezien celcultuurexperimenten gedeeltelijk reproduceren veelheid van factoren handelen in vivo, is het van groot belang redox studies uitgevoerd in diermodellen 24,25. Hiertoe is de zebravis beschouwd als een geschikte gewervelde diermodel oxidatieve stress dynamiek 26 bestuderen. De zebravis is een nieuw model systeem dat geeft een aantal voordelen om te studeren cellulaire en genetische gebeurtenissen tijdens gewervelde development en ziekte. Grote clusters van embryo's kunnen worden gegenereerd en wekelijks beschikbaar voor experimentele behoeften. Bovendien is de buitengewone optische helderheid van zebravis embryo's, evenals hun kleine formaat, kan via een cell imaging en dynamisch volgen in een hele organismen 27. In de afgelopen tien jaar hebben een aanzienlijk aantal zebravismutanten gegenereerd te modelleren van de menselijke pathologische aandoeningen zoals kanker en genetische ziekten 28-31. Het belangrijkste is, is een veelheid van transgene lijnen geproduceerd om uitgebreide mogelijkheden van genetische en biologische manipulaties 32 mogelijk te maken. Zo worden transgene weefselspecifieke zebravislijnen regelmatig gebruikt voor in vivo studies. Deze lijnen drukken een fluorescent eiwit onder de controle van een geselecteerde promoter, die de mogelijkheid om enkele cellen in vivo te identificeren, evenals de anatomische structuur die zij bevatten.

Verschillende toxicologische studies hebben reeds gebruikt thij zebravis over het in vivo effect van chemische stoffen op redox homeostase evalueren, suggereert de geschiktheid van deze gewervelde als een diermodel voor het gebied van geneesmiddelen en oxidatieve stress 33-35. Hoewel sommige fluorescerende probes getest om te controleren oxidatieve stress in zebravis larven 36,37, er geen vaste bepalingen om de niveaus van oxidatieve stress in zebravis weefsels en levende cellen te detecteren en te meten. Hier beschrijven we een werkwijze voor in vivo kwantificatie van oxidatieve stress in levende cellen van de zebravis embryo. Imaging gereedschappen, FACS-sortering, fluorescente probes en pro-oxidatieve voorwaarden wordt gecombineerd tot een eenvoudige test voor de detectie en kwantificering van oxidatieve deeltjes in zebravis embryo's en weefsels genereren.

Protocol

1. Voorbereiding van instrumenten en werkende oplossingen Bereid de vis water oplossing. Maak een voorraad oplossing door het oplossen van 2 g zeezout 'Instant Ocean' in 50 ml gedestilleerd water. Voeg 1,5 ml van de vis water tot 1 liter gedestilleerd water te bereiden klaar om vis water (60 ug / ml zeezout uiteindelijke concentratie) te gebruiken. Autoclaaf het klaar om te vissen water te gebruiken voor gebruik. Deze oplossing wordt gebruikt als zebravis embryo medium. Bereid methylcellulos…

Representative Results

Door toepassing van de hier beschreven methode, kunnen we gemakkelijk meten en detecteren oxidatieve stress (en ROS levels) in de zebravis embryonale weefsels. Na het oversteken volwassen zebravissen worden eieren verzameld en kunnen ontwikkelen bij 28 ° C tot 72 uur na bevruchting (HPF). Om oxidatieve stress induceren, stellen we twee verschillende benaderingen: 1) de behandeling van embryo's met sterke pro-oxidant reagentia of 2) het bevorderen van ROS vorming na weefselbeschadiging. …

Discussion

Kritische stappen

De procedure voor oxidatieve stress detectie in zebravis embryo hierin beschreven omvat twee verschillende methoden. De hele mount ROS-detectiemethode is vooral een kwalitatieve test voor ROS-detectie, terwijl de cel ROS-detectie methode is de specifieke kwantitatieve metingen (figuur 1). Beide methoden bieden een snelle en eenvoudige manier om in vivo ROS-detectie in zebravis embryo's te beoordelen. Maar ze beiden presenteren een aantal kritisch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes       (Life Technologies)  P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes         (Life Technologies)  A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
camera  ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease–an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles’ heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

Keywords: Oxidative StressReactive Oxygen SpeciesROSZebrafish EmbryosIn VivoFluorescent ROS ProbesTransgenic Fluorescent LinesWhole Embryo ROS-detectionSingle-cell ROS DetectionOxidant AgentsGenetic ScreensAnimal ModelsNeurological DisordersCancer
check_url/51328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image