ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה
Summary
Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.
Abstract
רמות גבוהה של מיני חמצן מגיבים (ROS) עלולות לגרום לשינוי במצב חיזור הסלולרי למצב עקה חמצונית. מצב זה גורם לחמצון של מולקולות (שומנים בדם, ה-DNA, חלבונים) ומוביל למותם של תאים. סטרס חמצונים גם משפיע על ההתקדמות של כמה מצבים פתולוגיים כגון סוכרת, Retinopathies, ניוון מוחיים, וסרטן. לפיכך, חשוב להגדיר בכלים כדי לחקור תנאי עקה חמצונית לא רק ברמה של תאים בודדים, אלא גם בהקשר של כל האורגניזמים. כאן, אנו רואים את עובר דג הזברה כשימושי במערכת vivo לבצע מחקרים כאלה ומציגים פרוטוקול למדידת לחץ חמצוני in vivo. ניצול של בדיקות ROS ניאון וקווי ניאון מהונדסים דג הזברה, אנו מפתחים שתי שיטות שונות למדידת לחץ חמצוני in vivo: ט) "שיטה כל עובר ROS איתור" למדידה איכותית של סטרס חמצונים וii) "תא בודד שיטת ROS זיהוי "למדידות כמותיות של סטרס חמצונים. בזאת, אנחנו מדגימים את יעילותם של הליכים אלה על ידי הגדלת לחץ חמצוני ברקמות על ידי סוכני חמצון ושיטות פיסיולוגיות או גנטיות. פרוטוקול זה הוא נוח למסכים גנטיים קדימה וזה יעזור לי יחסי כתובת סיבה ותוצאה של ROS במודלים של בעלי חיים של פתולוגיות הקשורות ללחץ חמצוני כגון הפרעות נוירולוגיות וסרטן.
Introduction
סטרס חמצונים מוגדר באופן ספציפי כתנאי הנובע ממצב חיזור סלולארי לא מאוזן. תגובות חיזור מורכבות המתרחשות באופן שיגרתי בתוך תאים לקבוע את חיזור המדינה הסלולרית. תגובות חיזור מורכבות מכל התגובות כימיות מורכבות בהעברת אלקטרונים בין האטומים של מולקולות ביולוגיות ייצור חיזור וחמצון של מולקולות (כלומר תגובות חיזור). התגובות הללו הן זרז על ידי מינים מופעלים באופן אלקטרוני (כלומר מינים פרו חמצוני-), המתאפיינים בחוסר יציבות מבנית קיצונית והפעלה ספונטנית של אלקטרונים לא מאוזנים שיחליפו עם ביומולקולות השכנה. תגובות לא סדירות אלה לגרום לניזק לדנ"א, carboxylation חלבון, וחמצון שומנים בדם, וסופו של דבר להוביל למוות של תאי 1. הרמות גבוהות של סטרס חמצונים כבר הקשורות להזדקנות וההתפתחות של מצבים פתולוגיים שונים 2. יש סטרס חמצוניםדווח להיות אחראי לשינויים בכלי הדם בסוכרת ומחלות לב וכלי דם 3,4. זה גם משחק תפקיד קריטי בניוון עצבי במחלת אלצהיימר ופרקינסון 5. יתר על כן, סטרס חמצונים הוכח כגורם קריטי בשלטון התקדמות סרטן ואירועים גרורתי 6,7. בנוסף, תגובות דלקתיות והחיסוניות עשויות לעורר לחץ חמצוני ותמיכה נוספת 8.
בתאים חיים, מינים הפרו חמצוני נגזרים מהחמצן (ROS; מיני חמצן תגובתי) או חנקן (RNS; מיני חנקן תגובתי). ROS כולל הידרוקסיל רדיקלי, אניון superoxide (OH). (O 2 -), ומי חמצן (H 2 O 2). RNS העיקרי הוא תחמוצת חנקן (NO).. סדרה של מינים תגובתי משניים יכולה להיות שנוצרה על ידי אינטראקציות ספונטניות between ROS וRNS או מתכות בחינם יוני 9. לדוגמא, אניון סופראוקסיד מגיב עם תחמוצת חנקן ליצירת peroxynitrate (ONOO -), ואילו H 2 O 2 מגיב עם Fe 2 + יוצר רדיקלים הידרוקסיל. ROS וRNS, בשל יכולתם להגיב עם כמה ביומולקולות, נחשבים איום מסוכן לשמירה על מדינת חיזור הפיזיולוגית 10. כדי לשמור על תאי מדינת חיזור מצוידים בסדרה של רעלים מולקולות נוגד חמצון ואנזימים. סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), Catalase, peroxidase גלוטתיון וPeroxiredoxins בעצם מהווים האנזימטית-הארסנל נוגד חמצון המספק הגנה תאית ממינים פרו חמצוני כוללים H 2 O 2, OH וOONO -. 11. גם מולקולות נוגדת חמצון כמו הוויטמין C ו-E, פוליפנולים וCoenzymeQ10 (CoQ10) הן בעלי חשיבות קריטית כדי להרוות ROS ודה המסוכנת שלהםrivatives 12,13. עם זאת, ייצור מוגבר של ROS וRNS, או חוסר תפקוד במערכת נוגד החמצון, מסיט את חיזור המדינה הסלולרית לסטרס חמצונים 14.
חוץ מהקונוטציה השלילית שלהם, ROS יכול לשחק תפקידים פיסיולוגיים שונים בתאים ממוצא שונה. תאים בדרך כלל מייצרים ROS כמולקולות איתות לתווך אירועים ביולוגיים נורמלים כגון הגנת מארחת ותיקון פצע 15-17. מינים תגובתי בדרך כלל מיוצרים בתאים על ידי אנזימים תאיים כגון NOX (NADPH אוקסידאז) וXO (Xantine אוקסידאז) בתגובה לגורמי איתות, גורמי גדילה, ותנודות תאיים של רמות סידן 18,19. זה כבר דווח כי ROS עשוי דיפרנציאלי לווסת את פעילותם של גורמים גרעיניים חשובים כגון p53 או מרכיבים תאיים כגון ATM-kinase, רגולטור של התגובה לנזק לדנ"א 20. באנלוגיה ROS מאוד להשפיע איתות הסלולר על ידי תיווך החמצון דואר ואיון של phosphatases החלבון טירוזין (PTPs), אשר הוקם כמכרעת בויסות העברת האותות 21. יתר על כן, שיטות proteomic מבוססים להוכיח כי RNS כן הם אחראים לשינויים חלבון מסוימים ושינויים של איתות מולקולרית. RNS להגיב עם קבוצות תיאול ציסטאין שינוים לS-nitrothiols (SNO) ומפעילות מסלולים מולקולריים במקביל למצבים פתולוגיים כגון מחלות דלקתיות ואוטואימוניות 22,23.
מאז ניסויי תרבית תאים באופן חלקי בלבד לשכפל מספר רב של גורמים הפועלים בvivo, זה הוא עניין רב לבצע מחקרי חיזור במודלים של בעלי החיים 24,25. כדי להשיג זאת, דג הזברה כבר נחשב מודל בעלי חיים בעלי חוליות מתאים ללמוד דינמיקת סטרס חמצונים 26. דג הזברה היא מודל למערכת חדשה המעניקה מספר יתרונות ללמוד אירועים תאיים וגנטיים בdev חוליותelopment ומחלות. אשכולות גדולים של עוברים יכולים להיות שנוצרו וזמינים שבועיים לצרכי ניסוי. יתר על כן הבהירות יוצאת דופן האופטית של עוברי דג הזברה, כמו גם גודלם הזעיר, מאפשר הדמיה תא בודדת ומעקב דינמי באורגניזמים שלמים 27. בעשור האחרון, מספר לא מבוטל של מוטציות דג הזברה כבר נוצר למודל מצבים פתולוגיים אדם כגון סרטן ומחלות גנטיות 28-31. והכי חשוב, מספר רב של קווים מהונדסים הופק כדי לאפשר הזדמנויות נרחבות של מניפולציות גנטיות וביולוגיות 32. לדוגמא, קווי דג הזברה רקמות ספציפיות מהונדסים מנוצלים באופן קבוע במחקרי vivo. קווים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של אמרגן שנבחר, המציע את היכולת לזהות תאים בודדים in vivo, כמו גם את המבנה האנטומי שהם מהווים.
מספר מחקרי טוקסיקולוגי כבר השתמשו tהוא דג הזברה כדי להעריך את השפעת vivo של כימיקלים על הומאוסטזיס חיזור, מה שמראה את התאמתם של חוליות זו כמודל חיה לתחום של גילוי תרופות וסטרס חמצונים 33-35. למרות כמה בדיקות ניאון נבדקו כדי לפקח על סטרס חמצונים בזחלי דג הזברה 36,37, אין מבחני הוקמו כדי לזהות ולמדוד את הרמות של סטרס חמצונים ברקמות דג הזברה ותאי חיים. כאן אנו מתארים הליך לכימות in vivo של סטרס חמצונים בתאים חי של עוברי דג הזברה. כל כלי הדמיה, FACS מיון, בדיקות ניאון ותנאים פרו חמצוני משולבים כדי ליצור assay פשוט לאיתור והכימות של מיני חמצוני בעוברים ורקמות דג הזברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים
ההליך לגילוי עקה חמצונית בעוברי דג הזברה שתוארו במסמך זה כולל שתי שיטות שונות. שיטת ההר ROS איתור כולו היא בעיקר assay איכותי לROS איתור, ואילו בשיטת ROS איתור התא הבודד מאפשרת מדידות כמותיות ספציפיות יותר (איור 1). ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hydrogen peroxide solution | SIGMA | 516813 | DO NOT STORE DILUITIONS |
| Hank's Balanced Salt Solution 1X | GIBCO | 14025 | |
| Methyl cellulose | SIGMA | M0387 | |
| Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture | INSTANT OCEAN | SS15-10 | |
| Tricaine | SIGMA | A5040 | |
| Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
| Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | dissolve one vial with 13μl of DMSO |
| Hydroethidine | INVITROGEN | D23107 | |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Prepare 5mM stock solution in DMSO. |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine | EnzoLifeScience | BML-EI395 | dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water |
| Propidium Iodide | Molecular probes (Life Technologies) | P3566 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | Molecular probes (Life Technologies) | A1310 | |
| Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' | Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 ) |
| Collagenase P | ROCHE | 11213857001 | Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082-147 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | ROCHE | Dissolve one tablet in 1ml of water | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red | GIBCO | 15400-054 | Prepare 1X working solution before usage |
| Compound microscope | ZEISS | ||
| Stereo microscope with fluorescent illumination | Nikon | AZ100 | |
| camera | ZEISS | AxioCamMRm | |
| software for fluorescence image acquisition | ZEISS | ZEN 2011 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| FACS tubes | BD | 342065 | |
| Multiwell Plate | BD Falcon | 353047 | |
| Sterilized, non treated Petri dishes 90mm | VWR | 391-1915 | |
| Confocal microscope | Leica | Leica SP5 |
References
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
- Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
- Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease–an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
- Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
- Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles’ heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
- Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
- Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
- Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
- Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
- Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
- Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
- Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
- Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
- Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
- Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
- Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
- Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
- Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
- Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
- Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
- Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
- Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
- Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
- Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
- Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
- Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
- Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
- Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
- Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
- Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
- Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).
