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Biology

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

Published: July 07, 2014
doi:
10.3791/51328
, ,
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science,University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology,Vesalius Research Center, VIB

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

Alti livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) possono causare un cambiamento di stato redox cellulare verso condizione di stress ossidativo. Questa situazione provoca ossidazione di molecole (lipidi, DNA, proteine) e porta alla morte delle cellule. Lo stress ossidativo influenza anche la progressione di diverse condizioni patologiche come il diabete, retinopatie, neurodegenerazione, e cancro. Quindi, è importante definire strumenti per studiare le condizioni di stress ossidativo non solo a livello di singole cellule, ma anche nel contesto di organismi interi. Qui, si considera l'embrione zebrafish come un utile sistema in vivo tali studi e presentare un protocollo per misurare in vivo stress ossidativo. Approfittando di sonde fluorescenti ROS e linee fluorescenti transgeniche zebrafish, sviluppiamo due metodi differenti per misurare lo stress ossidativo in vivo: i) un "metodo ROS-detection intero embrione" per la misura qualitativa dello stress ossidativo e ii) uno "unicellulare metodo di rilevazione ROS "per misure quantitative di stress ossidativo. Qui, dimostriamo l'efficacia di queste procedure, aumentando lo stress ossidativo nei tessuti da agenti ossidanti e metodi fisiologici o genetici. Questo protocollo è suscettibile per schermi genetiche in avanti e vi aiuterà relazioni indirizzo di causa-effetto di ROS in modelli animali di patologie legate allo stress ossidativo come disturbi neurologici e cancro.

Introduction

Lo stress ossidativo è specificamente definita come una condizione che deriva da uno stato redox cellulare sbilanciato. Le reazioni redox complesse che si verificano normalmente all'interno delle cellule determinano il redox-stato cellulare. Reazioni redox comprendono tutte le reazioni chimiche che consistono nel trasferimento di elettroni tra atomi di molecole biologiche che producono riduzione e ossidazione di molecole (ad esempio reazioni redox). Queste reazioni sono catalizzate da specie attivata elettronicamente (cioè le specie pro-ossidanti), caratterizzati da una instabilità strutturale estremo e l'attivazione spontanea di elettroni sbilanciati che scambiano con biomolecole limitrofi. Queste reazioni irregolari risultano in danni al DNA, proteine ​​carbossilazione, e l'ossidazione dei lipidi, e alla fine portano alla morte delle cellule 1. Aumento dei livelli di stress ossidativo sono stati associati con l'invecchiamento e la progressione di diversi stati patologici 2. Lo stress ossidativo èstato segnalato per essere responsabile di alterazioni vascolari nel diabete e le malattie cardiovascolari 3,4. Esso svolge anche un ruolo fondamentale nella degenerazione neuronale nella malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson 5. Inoltre, lo stress ossidativo è stato dimostrato come un fattore critico nel governo progressione del cancro ed eventi metastatici 6,7. Inoltre, le risposte infiammatorie e immunitarie possono suscitare e sostenere ulteriormente lo stress ossidativo 8.

In cellule viventi, specie pro-ossidative sono derivati ​​da ossigeno (ROS, specie reattive dell'ossigeno) o di azoto (RNS; specie reattive). ROS includono il radicale idrossile, l'anione superossido (OH.) (O 2 -), e il perossido di idrogeno (H 2 O 2). Il primario RNS è l'ossido di azoto (NO).. Una serie di specie reattive secondarie può essere generato da interazioni spontanee between ROS e RNS o metalli liberi ioni 9. Ad esempio, l'anione superossido reagisce con l'ossido di azoto per formare peroxynitrate (ONOO -), mentre H 2 O 2 reagisce con Fe 2 + genera radicali idrossilici. ROS e RNS, grazie alla loro capacità di reagire con diverse biomolecole, sono considerati una minaccia pericolosa per il mantenimento dello stato fisiologico redox 10. Per mantenere le cellule stato redox sono dotati di una serie di disintossicante molecole antiossidanti ed enzimi. La superossido dismutasi (SOD), catalasi, glutatione perossidasi e Peroxiredoxins costituiscono essenzialmente l'antiossidante enzimatico-arsenale che fornisce protezione cellulare da specie pro-ossidanti compreso H 2 O 2, OH e Oono -. 11. Anche molecole anti-ossidanti come la vitamina C ed E, polifenoli e CoenzymeQ10 (CoQ10) sono di importanza critica per placare ROS e la loro de pericolosarivati ​​12,13. Tuttavia, una eccessiva produzione di ROS e RNS, o una disfunzione del sistema antiossidante, sposta la redox-stato cellulare verso lo stress ossidativo 14.

Oltre alla loro connotazione negativa, ROS può svolgere vari ruoli fisiologici in cellule di diversa origine. Cellule normalmente producono ROS come molecole di segnalazione per mediare eventi biologici normali, come la difesa ospite e ferita riparazione 15-17. Specie reattive sono normalmente prodotti in cellule da enzimi intracellulari come NOx (NADPH) e XO (xantina ossidasi) in risposta a fattori di segnalazione, fattori di crescita e le fluttuazioni dei livelli di calcio intracellulare 18,19. E 'stato riportato che i ROS differenzialmente può modulare l'attività di importanti fattori nucleari come p53 o componenti cellulari come l'ATM-chinasi, il principale regolatore della risposta al danno del DNA 20. Analogamente ROS influenzano fortemente segnalazione cellulare mediando the ossidazione e inattivazione di proteina tirosina fosfatasi (PTP), che sono stabiliti come regolatori critici di trasduzione del segnale 21. Inoltre, le metodologie di proteomica basata dimostrano che RNS sono anche responsabili di specifiche modificazioni delle proteine ​​e alterazioni della segnalazione molecolare. RNS reagiscono con i gruppi tiolo cisteina li modificano in S-nitrothiols (SNO) e innescando meccanismi molecolari concomitanti con stati patologici come le malattie infiammatorie e autoimmuni 22,23.

Da esperimenti di coltura cellulare solo parzialmente riproducono la moltitudine di fattori che agiscono in vivo, è di grande interesse per eseguire studi redox in modelli animali 24,25. Per ottenere ciò, il zebrafish è stato considerato un modello animale vertebrato adatto per studiare la dinamica di stress ossidativo 26. Lo zebrafish è un nuovo modello di sistema che concede numerosi vantaggi di studiare eventi cellulari e genetici durante vertebrato development e la malattia. Grandi cluster di embrioni possono essere generate e disponibili settimanale per esigenze sperimentali. Inoltre, la straordinaria chiarezza ottica di embrioni di zebrafish, nonché le loro piccole dimensioni, permette l'imaging singola cellula e l'inseguimento dinamico in un insieme di organismi 27. Nell'ultimo decennio, un numero considerevole di zebrafish mutanti sono stati generati per modellare condizioni patologiche umane come il cancro e malattie genetiche 28-31. Ancora più importante, una moltitudine di linee transgeniche è stata prodotta per consentire ampie possibilità di manipolazioni genetiche e biologiche 32. Ad esempio, le linee transgeniche zebrafish tessuto-specifici sono regolarmente utilizzati per studi in vivo. Queste linee esprimono una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore selezionato, offrendo la possibilità di identificare le singole cellule in vivo, così come la struttura anatomica di comprendere.

Diversi studi tossicologici hanno già utilizzato tegli Zebrafish per valutare l'effetto in vivo delle sostanze chimiche sulla omeostasi redox, suggerendo l'idoneità di questo vertebrato come modello animale per il campo della scoperta di nuovi farmaci e stress ossidativo 33-35. Anche se alcuni sonde fluorescenti sono stati testati per monitorare lo stress ossidativo in larve di zebrafish 36,37, non ci sono test stabiliti per rilevare e misurare i livelli di stress ossidativo nei tessuti zebrafish e cellule viventi. Qui si descrive un procedimento per la quantificazione in vivo di stress ossidativo in cellule di embrioni di zebrafish vivente. Strumenti di imaging, FACS ordinamento, sonde fluorescenti e le condizioni pro-ossidative sono tutti combinati per generare un semplice test per l'individuazione e la quantificazione delle specie ossidanti in embrioni e tessuti di zebrafish.

Protocol

1. Preparazione di strumenti e soluzioni di lavoro Preparare la soluzione di acqua pesce. Ottenere una soluzione stock sciogliendo 2 g di 'Ocean istantanea' sali marini in 50 ml di acqua distillata. Aggiungere 1,5 ml di brodo di pesce di acqua a 1 L di acqua distillata per preparare pronto a utilizzare l'acqua del pesce (/ sali marini ml 60 mcg concentrazione finale). Autoclave pronto all'uso pesci d'acqua prima dell'uso. Questa soluzione viene utilizzata come mezzo zebrafish. <li…

Representative Results

Applicando il metodo descritto qui, possiamo facilmente misurare e rilevare lo stress ossidativo (e livelli di ROS) nei tessuti embrionali di zebrafish. Dopo aver attraversato zebrafish adulto, uova vengono raccolte e permesso di sviluppare a 28 ° C per 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Al fine di indurre stress ossidativo, proponiamo due diversi approcci: 1) Il trattamento degli embrioni con forti reagenti pro-ossidanti o 2) promuovere la formazione di ROS dopo la lesione del tessuto. Nel…

Discussion

Fasi critiche

La procedura per la rilevazione dello stress ossidativo in embrioni di zebrafish qui descritti comprende due metodi differenti. L'intero metodo di montaggio ROS rilevamento è principalmente un test qualitativo per ROS-rilevamento, mentre il metodo ROS rilevamento singola cella consente misurazioni quantitative più specifici (Figura 1). Entrambi i metodi offrono un modo rapido e semplice per valutare in vivo ROS-rilevazione sugli embrioni di zebrafi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes       (Life Technologies)  P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes         (Life Technologies)  A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
camera  ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5
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Keywords: Oxidative StressReactive Oxygen SpeciesROSZebrafish EmbryosIn VivoFluorescent ROS ProbesTransgenic Fluorescent LinesWhole Embryo ROS-detectionSingle-cell ROS DetectionOxidant AgentsGenetic ScreensAnimal ModelsNeurological DisordersCancer
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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).
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