Zebrafish भ्रूण में oxidative तनाव का विश्लेषण

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उच्च स्तर oxidative तनाव हालत की ओर सेलुलर redox राज्य के एक बदलाव के कारण हो सकता है. यह स्थिति अणुओं (लिपिड, डीएनए, प्रोटीन) के ऑक्सीकरण का कारण बनता है और कोशिका मृत्यु हो जाती है. ऑक्सिडेटिव तनाव भी प्रभाव डालता है जैसे मधुमेह, retinopathies, neurodegeneration, और कैंसर जैसे कई रोग की स्थिति की प्रगति. इस प्रकार, यह एकल कक्षों के स्तर पर ही नहीं बल्कि पूरी जीवों के संदर्भ में न केवल oxidative तनाव की स्थिति की जांच करने के लिए उपकरण को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम इस तरह पढ़ाई करते हैं और vivo में oxidative तनाव को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल को पेश करने के लिए vivo प्रणाली में एक उपयोगी रूप में zebrafish भ्रूण पर विचार करें. "मैं) एक oxidative तनाव के गुणात्मक माप के लिए" पूरे भ्रूण आरओएस का पता लगाने विधि "और द्वितीय) एक: फ्लोरोसेंट आरओएस जांच और zebrafish ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट लाइनों का लाभ उठाते हुए, हम इन विवो में oxidative तनाव को मापने के लिए दो अलग अलग तरीकों का विकासoxidative तनाव की मात्रात्मक मापन के लिए एकल कक्ष आरओएस पहचान पद्धति ". इस के साथ साथ, हम ऑक्सीडेंट एजेंटों और शारीरिक या आनुवंशिक तरीकों से ऊतकों में oxidative तनाव में वृद्धि से इन प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए उत्तरदायी है और यह इस तरह के मस्तिष्क संबंधी बीमारियों और कैंसर के रूप में ऑक्सीडेटिव तनाव संबंधी विकृतियों के पशु मॉडल में आरओएस के पते कारण प्रभाव रिश्तों में मदद मिलेगी.

Introduction

ऑक्सिडेटिव तनाव विशेष रूप से एक असंतुलित सेलुलर redox राज्य का परिणाम है कि एक शर्त के रूप में परिभाषित किया गया है. नियमित तौर पर कोशिकाओं के अंदर होती है कि जटिल redox प्रतिक्रियाओं सेलुलर redox राज्य का निर्धारण. Redox प्रतिक्रियाओं में कमी और अणुओं (यानी redox प्रतिक्रियाओं) के ऑक्सीकरण उत्पादन जैविक अणुओं के बीच परमाणु इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण में मिलकर बनता है कि सभी रासायनिक प्रतिक्रियाओं से मिलकर. इन प्रतिक्रियाओं एक चरम संरचनात्मक अस्थिरता और पड़ोसी biomolecules के साथ आदान प्रदान कि असंतुलित इलेक्ट्रॉनों का सहज सक्रियण की विशेषता है जो इलेक्ट्रॉनिक रूप से सक्रिय प्रजातियों (यानी समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजाति), द्वारा उत्प्रेरित कर रहे हैं. ये अनियमित प्रतिक्रियाओं डीएनए की क्षति, प्रोटीन carboxylation, और लिपिड ऑक्सीकरण में परिणाम है, और अंततः कोशिका मृत्यु ¹ पैदा होती हैं. Oxidative तनाव के स्तर में वृद्धि उम्र बढ़ने और विभिन्न रोग राज्यों ² की प्रगति के साथ संबद्ध किया गया है. ऑक्सिडेटिव तनाव हैमधुमेह और हृदय रोगों ^3,4 में संवहनी परिवर्तन के लिए जिम्मेदार होने की सूचना दी गई. यह भी अल्जाइमर रोग में neuronal अध: पतन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और पार्किंसंस रोग ^5. इसके अलावा, oxidative तनाव कैंसर प्रगति और metastatic घटनाओं ^6,7 गवर्निंग में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में प्रदर्शित किया गया है. इसके अलावा, सूजन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना और आगे समर्थन oxidative तनाव ⁸ मई.

या नाइट्रोजन (RNS, प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों), जीवित कोशिकाओं में, समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजातियों ऑक्सीजन (प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों आरओएस) से प्राप्त कर रहे हैं. (एच ₂ ओ _2), और हाइड्रोजन पेरोक्साइड ^– (ओ ₂₎ आरओएस superoxide आयनों, ^(. OH) हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी शामिल हैं. प्राथमिक RNS नाइट्रस ऑक्साइड ^(सं.) है. माध्यमिक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में से एक श्रृंखला betwee सहज बातचीत के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता हैn आरओएस और RNS या मुफ्त धातुओं ⁹ आयनों. एच ₂ ओ ₂ Fe ^{2 +} हाइड्रॉक्सिल कण उत्पन्न के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, उदाहरण के लिए ^– superoxide आयनों peroxynitrate (ONOO) के रूप में नाइट्रस ऑक्साइड के साथ प्रतिक्रिया करता है. आरओएस और RNS की वजह से कई biomolecules के साथ प्रतिक्रिया करने की क्षमता के लिए, शारीरिक redox राज्य ¹⁰ के रखरखाव के लिए एक बड़ा खतरा माना जाता है. बनाए रखने के लिए redox राज्य कोशिकाओं एंटी ऑक्सीडेंट अणुओं और एंजाइमों detoxifying की एक श्रृंखला से सुसज्जित हैं. ^{. 11 –} superoxide dismutase (वतन), catalase, glutathione peroxidase और Peroxiredoxins अनिवार्य रूप से एच _{2 2} हे, ओह, और OONO सहित समर्थक ऑक्सीडेटिव प्रजातियों से सेलुलर सुरक्षा प्रदान करता है कि एंटी ऑक्सीडेंट एंजाइमी-शस्त्रागार का गठन. इसके अलावा विटामिन सी और ई, polyphenols और CoenzymeQ10 (CoQ10) जैसे एंटी ऑक्सीडेंट अणुओं आरओएस और उनके खतरनाक डे बुझाने के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं^12,13 rivatives. हालांकि, आरओएस और RNS, या एंटी ऑक्सीडेंट प्रणाली में शिथिलता, के एक अत्यधिक उत्पादन oxidative तनाव ¹⁴ की ओर सेलुलर redox राज्य पाली.

उनके नकारात्मक अर्थ इसके अलावा, आरओएस अलग मूल की कोशिकाओं में विभिन्न शारीरिक भूमिका निभा सकते हैं. कोशिकाओं सामान्य रूप से इस तरह मेजबान सुरक्षा और घाव की मरम्मत ^15-17 के रूप में सामान्य जैविक घटनाओं मध्यस्थता संकेतन अणुओं के रूप में आरओएस का उत्पादन. रिएक्टिव प्रजातियां आम तौर पर संकेत कारकों, वृद्धि कारक है, और कैल्शियम का स्तर ^18,19 के intracellular उतार चढ़ाव के जवाब में इस तरह के NOX (NADPH oxidase) और XO (Xantine oxidase) के रूप में intracellular एंजाइमों से कोशिकाओं में उत्पादित कर रहे हैं. यह आरओएस विभिन्न तरह के p53 या इस तरह के एटीएम kinase, डीएनए की क्षति ²⁰ के जवाब का एक मास्टर नियामक के रूप में सेलुलर घटकों के रूप में महत्वपूर्ण परमाणु कारकों की गतिविधि मिलाना सकता है कि सूचना मिली है. तुलनात्मक रूप से आरओएस जोरदार वें मध्यस्थता द्वारा सेलुलर संकेत को प्रभावितई ऑक्सीकरण और संकेत पारगमन ²¹ की महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में स्थापित कर रहे हैं, जो प्रोटीन tyrosine फास्फेटेजों (PTPs), की निष्क्रियता. इसके अलावा, प्रोटिओमिक आधारित तरीके RNS भी विशिष्ट प्रोटीन संशोधनों और आणविक संकेत के परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं कि प्रदर्शित करता है. RNS एस nitrothiols (SNO) में उन्हें संशोधित करने और इस तरह के भड़काऊ और autoimmune रोग ^22,23 के रूप में रोग राज्यों के साथ सहवर्ती आणविक मार्ग ट्रिगर सिस्टीन thiol समूहों के साथ प्रतिक्रिया.

सेल संस्कृति प्रयोगों केवल आंशिक रूप से विवो में अभिनय कारकों की भीड़ पुन: पेश हैं, यह पशु मॉडल ^24,25 में redox पढ़ाई प्रदर्शन करने के लिए महान ब्याज की है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, zebrafish oxidative तनाव गतिशीलता ²⁶ अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त हड्डीवाला पशु मॉडल माना गया है. zebrafish कई फायदे हड्डीवाला देव दौरान सेलुलर और आनुवंशिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुदान कि एक नया मॉडल प्रणाली हैelopment और रोग. भ्रूण के बड़े समूहों प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए साप्ताहिक उत्पन्न और उपलब्ध किया जा सकता है. इसके अलावा zebrafish भ्रूण की असाधारण ऑप्टिकल स्पष्टता, साथ ही अपने छोटे आकार, एक पूरे जीवों ²⁷ में एकल कक्ष इमेजिंग और गतिशील ट्रैकिंग सक्षम बनाता है. पिछले दशक में, zebrafish म्यूटेंट के एक काफी संख्या में इस तरह के कैंसर और आनुवंशिक रोगों ^28-31 के रूप में मानव रोग की स्थिति के लिए मॉडल उत्पन्न किया गया है. सबसे महत्वपूर्ण बात, ट्रांसजेनिक लाइनों की एक भीड़ आनुवंशिक और जैविक जोड़तोड़ ³² की विस्तृत अवसर अनुमति देने के लिए निर्मित किया गया है. उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक ऊतक विशेष zebrafish लाइनों नियमित रूप से vivo अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. इन लाइनों vivo में एकल कक्षों की पहचान करने की क्षमता है, साथ ही वे शामिल शारीरिक संरचना की पेशकश की एक चयनित प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं.

कई विषाक्तता अध्ययन पहले से ही टी का इस्तेमाल किया हैवह दवाओं की खोज और oxidative तनाव ^33-35 के क्षेत्र के लिए एक पशु मॉडल के रूप में इस हड्डीवाला की उपयुक्तता, सुझाव redox homeostasis पर रसायनों के vivo प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए zebrafish. कुछ फ्लोरोसेंट जांच zebrafish लार्वा ^36,37 में oxidative तनाव की निगरानी के लिए परीक्षण किया गया है, भले ही zebrafish ऊतकों में oxidative तनाव का स्तर और जीवित कोशिकाओं का पता लगाने और मापने के लिए कोई स्थापित assays कर रहे हैं. यहाँ हम zebrafish भ्रूण की जीवित कोशिकाओं में oxidative तनाव के vivo मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. इमेजिंग उपकरणों, FACS छँटाई, फ्लोरोसेंट जांच और समर्थक ऑक्सीडेटिव स्थितियां सभी zebrafish भ्रूण और ऊतकों में पता लगाने और oxidative प्रजातियों की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल परख उत्पन्न करने के लिए संयुक्त रहे हैं.

Protocol

उपकरण और कार्य समाधान के 1. तैयारी मछली पानी के घोल तैयार करें. आसुत पानी की 50 मिलीलीटर में समुद्री नमक 'त्वरित महासागर' के 2 जी भंग करके एक शेयर समाधान करें. मछली पानी (60 माइक्रोग्राम / एमएल सागर नमक अ…

Representative Results

यहाँ वर्णित विधि को लागू करके, हम आसानी से उपाय कर सकते हैं और zebrafish भ्रूण के ऊतकों में oxidative तनाव (और आरओएस स्तर) का पता लगा. वयस्क zebrafish पार करने के बाद, अंडे एकत्र की है और 72 घंटे के बाद निषेचन (HPF) को 28 डिग्री सेल्?…

Discussion

गंभीर कदम

यहाँ बताया zebrafish भ्रूण में oxidative तनाव का पता लगाने के लिए प्रक्रिया को दो अलग अलग तरीकों शामिल हैं. एकल कक्ष आरओएस का पता लगाने विधि (चित्रा 1) और अधिक विशिष्ट मात्रात्मक माप की अनु?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Hydrogen peroxide solution	SIGMA	516813	DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X	GIBCO	14025
Methyl cellulose	SIGMA	M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture	INSTANT OCEAN	SS15-10
Tricaine	SIGMA	A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent	INVITROGEN	C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX	INVITROGEN	M36008	dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine	INVITROGEN	D23107
Rotenone	SIGMA	R8875	Prepare 5mM stock solution in DMSO.
Dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine	EnzoLifeScience	BML-EI395	dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide	Molecular probes       (Life Technologies)	P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	Molecular probes         (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3'	Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P	ROCHE	11213857001	Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO	10010-056
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	ROCHE		Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red	GIBCO	15400-054	Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope	ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination	Nikon	AZ100
camera	ZEISS	AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition	ZEISS	ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter	BD FACSCalibur
Centrifuge	Eppendorf	5417R
FACS tubes	BD	342065
Multiwell Plate	BD Falcon	353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm	VWR	391-1915
Confocal microscope	Leica	Leica SP5