Analys av oxidativ stress i Zebrafish embryon

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

Höga nivåer av reaktiva syreradikaler (ROS) kan orsaka en förändring av cellulär redoxtillstånd mot oxidativ stress skick. Denna situation orsakar oxidation av molekyler (lipid, DNA, protein) och leder till celldöd. Oxidativ stress påverkar också utvecklingen av ett flertal sjukdomstillstånd som diabetes, retinopatier, neurodegeneration, och cancer. Således är det viktigt att definiera verktyg för att undersöka oxidativa stressbetingelser inte endast på nivån för enskilda celler, utan även i samband med hela organismer. Här anser vi den zebrafisk embryot som ett användbart in vivo-system för att utföra sådana undersökningar och presentera ett protokoll för att mäta in vivo oxidativ stress. Med utnyttjande av fluorescerande ROS sonder och zebrafisk transgena fluorescerande linjer, utvecklar vi två olika metoder för att mäta oxidativ stress in vivo: i) en "hel embryo ROS-detekteringsmetod" för kvalitativ mätning av oxidativ stress och ii) en "encelliga ROS detekteringsmetod "för kvantitativa mätningar av oxidativ stress. Häri visar vi effekten av dessa förfaranden genom att öka oxidativ stress i vävnader med oxiderande agenter och fysiologiska eller genetiska metoder. Detta protokoll är mottaglig för framåt genetiska skärmar och det kommer att hjälpa till orsakssamband av ROS i djurmodeller av oxidativa stressrelaterade sjukdomar såsom neurologiska sjukdomar och cancer.

Introduction

Oxidativ stress är specifikt definierad som ett tillstånd som är resultatet av en obalanserad cellulära redox staten. De komplexa redoxreaktioner som rutinmässigt förekommer inuti cellerna bestämma den cellulära redox-tillstånd. Redoxreaktioner består av alla kemiska reaktioner, som består i överföring av elektroner mellan atomer av biologiska molekyler som producerar reduktion och oxidation av molekyler (dvs. redoxreaktioner). Dessa reaktioner katalyseras av elektroniskt aktiverade ämnen (dvs. prooxidativa arter), som kännetecknas av en extrem strukturell instabilitet och spontan aktivering av obalanserade elektroner som utbyter med grann biomolekyler. Dessa oregelbundna reaktioner resulterar i DNA-skada, protein karboxylering och lipidoxidation, och så småningom leda till celldöd ^1. Ökade nivåer av oxidativ stress har förknippats med åldrande och progressionen av olika patologiska tillstånd ^2. Oxidativ stress harrapporterats vara ansvarig för vaskulära förändringar i diabetes och hjärt-och kärlsjukdomar ^3,4. Den spelar också en avgörande roll i neuronal degenerering vid Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom ^5. Dessutom har oxidativ stress visats som en kritisk faktor som styr cancerprogression och metastaserande händelser ^6,7. Dessutom kan inflammation och immunsvar framkalla och ytterligare stöd oxidativ stress ^8.

I levande celler, är pro-oxidativa arter härstammar från syre (ROS, reaktiva syreradikaler) eller kväve (RNS, reaktiva kvävearter). ROS inkluderar hydroxylradikalen, superoxidanjonen ^(OH.) (O ₂ ^-) och väteperoxid (H ₂ O _2). Den primära RNS är kväveoxid ^(NO.). En serie av sekundära reaktiva species kan genereras genom spontana interaktioner mellan ROS och RNS eller fria metaller joner ^9. Exempelvis reagerar superoxidanjonen med dikväveoxid för bildning peroxynitrate (ONOO ^-), medan H ₂ O ₂ att reagera med Fe ^{2 +} genererar hydroxylradikaler. ROS och RNS, på grund av deras förmåga att reagera med olika biomolekyler, betraktas som ett farligt hot för underhåll av den fysiologiska redox staten ^10. För att bibehålla redoxtillståndet celler är utrustade med en serie av avgifta antioxidant molekyler och enzymer. Den superoxiddismutas (SOD), katalas, glutation-peroxidas och Peroxiredoxins utgöra väsentligen antioxidant enzymatisk-arsenal som ger cellulär skydd mot pro-oxidativa species inklusive H ₂ O _2, OH och OONO ^{-. 11.} Även antioxidant molekyler som vitamin C och E, polyfenoler och CoenzymeQ10 (Q10) är av avgörande betydelse för att släcka ROS och deras farliga dederivat ^12,13. Men en överdriven produktion av ROS och RNS, eller en dysfunktion i antioxidant-system, skiftar den cellulära redox-tillstånd mot oxidativ stress ^14.

Vid sidan av sin negativa klang, kan ROS spela olika fysiologiska roller i celler av olika ursprung. Celler producerar normalt ROS som signalmolekyler för att medla normala biologiska händelser såsom värdförsvar och sårläkning ^15-17. Reaktiva arter normalt produceras i celler av intracellulära enzymer såsom NOX (NADPH-oxidas) och XO (Xantine Oxidas) som svar på signalerings faktorer, tillväxtfaktorer och intracellulära fluktuationerna av kalciumnivåer ^18,19. Det har rapporterats att ROS differentiellt kan modulera aktiviteten av viktiga nukleära faktorer såsom p53 eller cellulära komponenter, såsom ATM-kinas, en huvudregulator av svaret på DNA-skada ^20. Analogt ROS starkt påverka cellulär signalering genom att förmedla ee oxidation och inaktivering av protein tyrosinfosfataser (PTP), som är etablerade som kritiska regulatorer av signaltransduktion ^21. Dessutom, proteomik baserade metoder visar att RNS är också ansvariga för specifika protein modifieringar och ändringar av molekylär signalering. RNS reagerar med de cysteintiolgrupper modifierar dem till S-nitrothiols (SNO) och utlöser molekylära vägar samtidigt med patologiska tillstånd, såsom inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar ^22,23.

Eftersom cellkulturexperiment endast delvis återge de många faktorer som verkar in vivo, är det av stort intresse att utföra redox studier i djurmodeller ^24,25. För att uppnå detta har zebrafisk ansetts vara en lämplig ryggradsdjur modell för att studera oxidativ stress dynamik ^26. Den zebrafisk är ett nytt modellsystem som ger flera fördelar för att studera cellulära och genetiska händelser under ryggradsdjur deveckling och sjukdom. Kan genereras och tillgängliga Stora kluster av embryon i veckan för experimentella behov. Dessutom den extra optiska klarheten av zebrafiskembryon, samt sin ringa storlek, möjliggör enskild cell imaging och dynamisk spårning i ett helt organismer ^27. Under det senaste decenniet, har ett betydande antal zebrafisk mutanter tagits fram för att modellera mänskliga patologiska tillstånd som cancer och genetiska sjukdomar ^28-31. Viktigast har en mångfald av transgena linjer tagits fram för att möjliggöra omfattande möjligheter för genetiska och biologiska manipulationer ^32. Till exempel är transgena vävnadsspecifika zebrafisklinjer regelbundet utnyttjas för in vivo-studier. Dessa linjer uttrycka ett fluorescerande protein under kontroll av en utvald promotor, och ger förmåga att identifiera enstaka celler in vivo, såväl som den anatomiska strukturen de utgör.

Flera toxikologiska studier har redan använt than zebrafisk att utvärdera effekten in vivo av kemikalier på redox homeostas, vilket tyder på lämpligheten av detta ryggradsdjur som en djurmodell för området läkemedelsutveckling och oxidativ stress ^33-35. Även om vissa fluorescerande prober har testats för att övervaka oxidativ stress i zebrafisk larver ^36,37, det finns inga etablerade analyser för att upptäcka och mäta nivåerna av oxidativ stress i zebrafisk vävnader och levande celler. Här beskriver vi ett förfarande för in vivo kvantifiering av oxidativ stress i levande celler i zebrafisk embryon. Bildframställning, FACS sortering, fluorescerande prober och pro-oxidativa förhållanden är alla kombineras för att skapa en enkel analys för detektion och kvantifiering av oxidativa arter i zebrafisk embryon och vävnader.

Protocol

1. Beredning av instrument och arbetslösningar Förbered fisk vattenlösning med. Gör en stamlösning genom att lösa 2 g havssalt Instant Ocean "i 50 ml destillerat vatten. Lägg till 1,5 ml lager fisk vatten till 1 liter destillerat vatten för att förbereda redo att använda fisk vatten (60 mikrogram / ml havssalt slutlig koncentration). Autoklav den färdig att använda fisk vatten före användning. Denna lösning används som zebrafisk embryo medium. Förbered metylcellulosa för embry…

Representative Results

Genom att tillämpa den metod som beskrivs här, kan vi enkelt mäta och påvisa oxidativ stress (och ROS nivåer) i zebrafisk embryonala vävnader. Efter att ha korsat vuxna zebrafisk, är äggen uppsamlades och tilläts utvecklas vid 28 ° C till 72 h efter befruktning (HPF). För att framkalla oxidativ stress, föreslår vi två olika metoder: 1) i behandling av embryon med starka prooxidativa reagenser eller 2) att främja ROS bildning efter vävnadsskada. I den första metoden, använde…

Discussion

Kritiska steg

Förfarandet för oxidativ stress detektering i zebrafiskembryon beskrivs häri innefattar två olika metoder. Hela berget ROS-detekteringsmetod är främst en kvalitativ analys för ROS-detektion, medan den enda cell ROS-detekteringsmetod tillåter mer specifika kvantitativa mätningar (Figur 1). Båda metoderna ger ett snabbt och enkelt sätt att utvärdera in vivo ROS-detektion på zebrafisk embryon. Men de båda presenterar några viktiga steg.

<…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Hydrogen peroxide solution	SIGMA	516813	DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X	GIBCO	14025
Methyl cellulose	SIGMA	M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture	INSTANT OCEAN	SS15-10
Tricaine	SIGMA	A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent	INVITROGEN	C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX	INVITROGEN	M36008	dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine	INVITROGEN	D23107
Rotenone	SIGMA	R8875	Prepare 5mM stock solution in DMSO.
Dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine	EnzoLifeScience	BML-EI395	dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide	Molecular probes       (Life Technologies)	P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	Molecular probes         (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3'	Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P	ROCHE	11213857001	Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO	10010-056
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	ROCHE		Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red	GIBCO	15400-054	Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope	ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination	Nikon	AZ100
camera	ZEISS	AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition	ZEISS	ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter	BD FACSCalibur
Centrifuge	Eppendorf	5417R
FACS tubes	BD	342065
Multiwell Plate	BD Falcon	353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm	VWR	391-1915
Confocal microscope	Leica	Leica SP5