و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة
Summary
مجمعات البروتين متعدد العناصر تلعب دورا حاسما خلال وظيفة الخلوية والتنمية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل المجمعات البروتين الأصلي من أجنة ذبابة الفاكهة في الجسم الحي بعد يشابك تليها تنقية المجمعات crosslinked لاحقة تحليل هيكل وظيفة.
Abstract
يتم التحكم في العديد من العمليات الخلوية عن طريق المجمعات البروتين multisubunit. كثيرا ما تشكل هذه المجمعات عابر وتتطلب البيئة المحلية لتجميع. لذلك، لتحديد هذه المجمعات البروتين وظيفية، من المهم لتحقيق الاستقرار لهم في الجسم الحي قبل تحلل الخلايا وتنقية لاحقة. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل كبير مجمعات البروتين حسن النية من أجنة ذبابة الفاكهة. ويستند هذا الأسلوب على permeabilization الجنين والاستقرار في المجمعات داخل الأجنة في الجسم الحي بواسطة يشابك باستخدام تركيز منخفض من الفورمالديهايد، والتي يمكن بسهولة عبر غشاء الخلية. في وقت لاحق، وimmunopurified مجمع البروتين من الفائدة تليها تنقية جل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. نحن لتوضيح هذه الطريقة باستخدام تنقية مجمع البروتين تيودور، وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية. تيودور هو بروتين كبيرة، والذي يحتوي على مجالات متعددة تيودور – الصغيرةالوحدات التي تتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينات المستهدفة. هذه الطريقة يمكن تكييفها لعزل المجمعات البروتين الأصلي من الكائنات الحية والأنسجة المختلفة.
Introduction
يتم تنفيذ عزل التجمعات البروتين multisubunit والمجمعات الحمض النووي RNA أو البروتين لتحديد المجمعات البروتين، ومواضع الجيني معترف بها من قبل البروتينات التنظيمية ملزمة الحمض النووي RNA أو أهداف من البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي. طرق مختلفة تسمح تحديد على نطاق الجينوم الحمض النووي من المواقع المعترف بها من قبل عوامل النسخ أو البروتينات لونين (رقاقة وما يليها) 1 وأهداف RNA يرتبط مع بروتين ملزمة الحمض النووي الريبي معين (CLIP وما يليها) 2. ثم يتم التسلسل عميق مكتبات cDNAs المستمدة من الحمض النووي الريبي DNA أو أهداف. استخدام هذه الأساليب الكيميائية أو عبر ربط لتحقيق الاستقرار في المجمعات تليها مناعي (IP) مع الأجسام المضادة ضد أحد مكونات البروتين من مجمع درس الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية.
خلال تطوير كائن حي، وكثير من المجمعات البروتين تشكيل عابر. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحليل تكوين وظيفة هذه المجمعات في الجسم الحي لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديفelopment. ان مثل هذا التحليل في الجسم الحي تكون متفوقة على النهج في المختبر لأنه يكاد يكون من المستحيل لإعادة إنتاج تركيزات مواطن من مكونات التفاعل والبيئة البيوكيميائية الخلوية في المختبر. نحن هنا إثبات وجود في الجسم الحي النهج التي نستخدمها بنجاح لعزل البروتين المجمعات الكبيرة من أجنة ذبابة الفاكهة. في هذه الطريقة، crosslinked المجمعات البروتين في الأجنة الحية مع تركيز منخفض من الفورمالديهايد، وبعد ذلك يتم عزل المجمعات البروتين من الفائدة عن طريق IP مع الأجسام المضادة ضد عنصر معروف من المجمعات تليها هلام تطهير المجمعات وتحليل الطيف الكتلي ل تحديد مكونات معقدة غير معروفة. منذ الفورمالديهايد قادرة على تتخلل غشاء الخلية ويبلغ مداه يشابك من 2،3-2،7 Å 3، مجمعات البروتين يمكن crosslinked في الجسم الحي، ويحتمل أن تكون قريبة من بعضها البعض في مكونات معقدة. في هذه المادة ونحنتصف هذه الطريقة باستخدام عزلة تيودور (TUD) بروتين معقد كمثال على ذلك. TUD هو بروتين سلالة الجرثومية وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية 4-7. هذا البروتين يحتوي على 11 المجالات TUD معروفة للتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينية الأخرى 8-10.
في السابق، ونحن قد ولدت خط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر HA الموسومة الوظيفية TUD 5 وبالتالي، يتم استخدام محددة لمكافحة HA الأجسام المضادة لهدم مجمع TUD بعد يشابك.
بالإضافة إلى crosslinks البروتين البروتين، يمكن أن الفورمالديهايد توليد النووي crosslinks حمض البروتين ويستخدم في التجارب رقاقة وما يليها. علاوة على ذلك، في ذبابة الفاكهة، في الجسم الحي مع يشابك الفورمالديهايد سمحت تحديد هدف الحمض النووي الريبي من البروتين RNA helicase فاسا 11.
بينما في هذه المادة ونحن تصف طريقة لفي الجسم الحي يشابك وبورification المجمعات البروتين من أجنة ذبابة الفاكهة، وهذه الطريقة يمكن تكييفها للكائنات والأنسجة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد الفورمالديهايد يشيع استخدامها بوصفها كاشف يشابك لتحديد البروتين البروتين والحمض النووي البروتين التفاعلات. حسن الذوبان ونفاذية غشاء الخلية، جنبا إلى جنب مع التوافق مع الإجراءات مطياف الكتلة المصب، وجعل الفورمالديهايد وكيل المرشح المثالي لتطبيقات الخلايا يشا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأردن ديفيس، يانيان لين، اريك شادلر وJimiao تشنغ للمساعدة التقنية مع هذه الدراسة. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني وظيفيه منح MCB-1054962 لALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694 (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
