Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen
Summary
Mehrkomponenten-Protein-Komplexe spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Funktion und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Verfahren verwendet, um native Protein-Komplexe von Drosophila-Embryonen isoliert nach in vivo Vernetzung durch Reinigung der vernetzten Komplexe für die nachfolgende Struktur-Funktions-Analyse.
Abstract
Viele zelluläre Prozesse werden von mehreren Unterproteinkomplexe gesteuert. Häufig werden diese Komplexe zu bilden vorübergehend und erfordern nativen Umgebung zu montieren. Deshalb, um diese funktionellen Protein-Komplexe zu identifizieren, ist es wichtig, sie in vivo vor der Zell-Lyse und anschließender Reinigung stabilisieren. Hier beschreiben wir eine Methode verwendet, um große Bona-fide-Protein-Komplexe von Drosophila-Embryonen zu isolieren. Dieses Verfahren wird auf den Embryo Permeabilisierung und Stabilisierung der Komplexe in den Embryonen von in vivo Vernetzung unter Verwendung einer niedrigen Konzentration an Formaldehyd, die leicht überqueren die Zellmembran beruht. Anschließend wird die Proteinkomplex von Interesse immungereinigt, gefolgt von der Gelreinigung und durch Massenspektrometrie analysiert. Wir veranschaulichen dieses Verfahren unter Verwendung eines Reinigungs Tudor-Protein-Komplex, die für die Keimbahn-Entwicklung ist. Tudor ist ein großes Protein, das mehrere Tudor-Domänen enthält – kleinModule, die mit methylierte Lysine oder Arginine von Zielproteinen wechselwirken. Diese Methode kann für die Isolierung von nativen Proteinkomplexe aus verschiedenen Organismen und Geweben angepasst werden.
Introduction
Isolierung von Protein aus mehreren Unterbaugruppen und DNA-oder RNA-Protein-Komplexen durchgeführt, um Proteinkomplexe, genomische Loci von DNA-bindenden regulatorischen Proteine oder RNA-Targets von RNA-bindenden Proteinen erkannt identifizieren. Verschiedene Methoden ermöglichen genomweiten Identifizierung von DNA-Stellen von Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-Proteine (ChIP-Seq) 1 und RNA-Targets mit einer bestimmten RNA-bindenden Protein (CLIP-Seq) 2 zugeordnet anerkannt. Die Bibliotheken der RNA-oder DNA-cDNAs abgeleiteten Ziele werden dann tief sequenziert. Diese Verfahren verwenden chemische oder UV-induzierte Vernetzung, um die Komplexe, gefolgt von Immunopräzipitation (IP) mit einem Antikörper gegen ein Protein-Komponente des Komplexes untersucht stabilisieren.
Während der Entwicklung eines Organismus bilden viele Proteinkomplexe transient. Daher ist es von entscheidender Bedeutung zur Analyse der Zusammensetzung und Funktion dieser Komplexe in vivo, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Entwickler zu steuernelopment. Solch ein in vivo-Analyse überlegen wäre in vitro-Ansatz, da es praktisch unmöglich ist, nativen Konzentrationen der zusammenwirkenden Komponenten und zelluläre biochemische Umgebung in vitro zu reproduzieren. Hier zeigen wir eine in vivo-Ansatz, den wir verwenden, erfolgreich auf großen Proteinkomplexen von Drosophila-Embryonen zu isolieren. In diesem Verfahren werden Protein-Komplexe in den lebenden Embryonen mit einer niedrigen Konzentration von Formaldehyd und anschließender Proteinkomplexe von Interesse werden von IP mit einem Antikörper isoliert gegen eine bekannte Komponente des Komplexes, gefolgt von der Gelreinigung der Komplexe und Massenspektrometrie-Analyse zu vernetzenden identifizieren unbekannt komplexe Bauteile. Da Formaldehyd in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen und eine Vernetzungs Bereich von 2,3-2,7 Å 3, können Protein-Komplexen in vivo, vernetzt werden und die komplexen Bauteilen, die nahe zueinander zu sein. In diesem Artikel werden wirbeschreiben dieses Verfahren mit der Isolierung von Tudor (TUD) Proteinkomplex als Beispiel. Tud ist eine Keimbahn-Protein, die für die Entwicklung der Keimbahn 4-7 ist. Dieses Protein enthält 11 Tud Domains bekannt, mit methylierte Arginine Lysine oder von anderen Polypeptiden 8-10 interagieren.
Früher haben wir eine transgene Drosophila-Linie, die HA-markierte Funktions Tud 5 drückt, und daher wird spezifische Anti-HA-Antikörper verwendet, um komplexe Tud nach Vernetzung Pulldown generiert haben.
Zusätzlich zu Protein-Protein-Quervernetzungen können Formaldehyd Nukleinsäure-Protein-Vernetzungen zu erzeugen, und wird in der Chip-seq Experimente verwendet. Ferner ist in Drosophila, in vivo Vernetzung mit Formaldehyd hat die Identifizierung eines RNA-Ziel-RNA-Helicase-Protein Vasa 11 erlaubt.
Während in diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren für die In-vivo-und Vernetzungs purifizierung von Proteinkomplexen von Drosophila-Embryonen, kann dieses Verfahren für andere Organismen und Gewebe angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formaldehyd wurde üblicherweise als Vernetzungsmittel für die Identifizierung von Protein-Protein-und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen verwendet. Seine gute Löslichkeit und Permeabilität der Zellmembran, zusammen mit der Kompatibilität mit nachgeschalteter Massenspektrometrie Verfahren machen Formaldehyd ein idealer Kandidat für die intrazelluläre Vernetzungsmittel Anwendungen 3,15-17. Insbesondere wurde es erfolgreich eingesetzt, um mRNAs mit Vasa, einen kritischen Keimzelle RNA-Helikase in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler und Jimiao Zheng für ihre technische Hilfe zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde von der NSF CAREER unterstützt gewähren MCB-1054962 ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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