Bir In vivo Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar
Summary
Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder.
Abstract
Pek çok hücresel süreçleri multisubunit protein kompleksleri tarafından kontrol edilir. Sıkça bu kompleksler geçici oluşturmak ve birleştirmek için doğal bir ortam gerektirir. Bu nedenle, bu işlevsel protein kompleksleri tespit etmek için, hücre lizizi ve daha sonra saflaştırma daha önce in vivo olarak bunları stabilize etmek için önemlidir. Burada Drosophila embriyolardan büyük niyetli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, hücre zarını kolayca geçebilir formaldehit düşük bir konsantrasyonu kullanılarak in vivo çapraz bağlama ile embriyoların içine komplekslerin embriyo nüfuziyet ve stabilizasyon dayanmaktadır. Daha sonra, ilgilenilen protein kompleksi jel geçirilmiş, ardından arıtma ve kütle spektrometresi ile analiz edilir İmmüno. Bu tohum çizgisi gelişimi için gerekli olan bir Tudor protein kompleksi, saflaştırılmasını kullanarak bu yöntemi örneklemektedir. – Küçük Tudor birden Tudor etki alanı içeren büyük bir proteindirHedef proteinlerin metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim modülleri. Bu yöntem, farklı organizmalardan ve dokulardan yerli protein komplekslerinin izolasyonu için uyarlanabilir.
Introduction
Multisubunit protein montajlar ve DNA-ya da RNA-protein komplekslerinin izolasyonu protein kompleksleri, DNA-bağlanma düzenleyici proteinler veya RNA bağlama proteinlerinin RNA hedefleri tarafından kabul genomik lokusları tespit için gerçekleştirilir. Farklı yöntemler, belirli bir RNA-bağlama proteini (CLIP-seq) 2 ile ilişkili transkripsiyon faktörleri veya kromatin proteinleri (ChIP-seq) 1 ve RNA hedefleri tarafından tanınan DNA siteleri genom tanımlanmasını sağlar. RNA türetilmiş cDNA ya da DNA hedeflerinin diziler daha sonra derin dizilir. Bu yöntemler, kimyasal veya UV kaynaklı çalışılan kompleksinin bir protein bileşenine karşı bir antikor ile immüno-çökeltme (IP) takip kompleksleri stabilize etmek için çapraz bağlama kullanın.
Bir organizmanın gelişimi sırasında, çok sayıda geçici protein kompleksleri oluşturur. Bu nedenle, kontrol dev moleküler mekanizmaların anlaşılması, in vivo olarak, bu komplekslerin bileşimi ve işlevini analiz için çok önemlidirelopment. Bu etkileşim bileşenleri ve in vitro olarak hücre biyokimyasal ortamı yerel konsantrasyonları üretmek için neredeyse imkansız olduğu için bu tür bir in vivo analiz in vitro yaklaşımına göre daha üstün olacaktır. Burada biz başarılı Drosophila embriyolar büyük protein kompleksleri izole etmek için kullanabileceğiniz bir in vivo yaklaşım göstermektedir. Bu yöntemde, canlı embriyolar protein kompleksleri düşük formaldehit konsantrasyonu ve daha sonra ilgi protein kompleksleri için kompleksleri ve kütle spektrometre analizi jel geçirilmiş, ardından arıtma komplekslerinin bilinen bir bileşenine karşı bir antikor ile IP ile izole edilir ile çapraz bağlanmış olan bilinmeyen karmaşık bileşenleri tanımlar. Formaldehit hücre zarı nüfuz edebilir ve 2.3-2.7 Â 3 bir dizi çapraz bağlama sahip olduğu için, protein kompleksleri, in vivo olarak çapraz bağlanabilir ve karmaşık parçaları birbirine yakın olması muhtemeldir. Bu makalede bizBir örnek olarak Tudor (Tud) protein kompleksinin izole edilmesini kullanarak bu yöntem açıklanmaktadır. Tud tohum çizgisi 4-7 gelişimi için gerekli olan bir tohum çizgisi proteindir. Bu protein için diğer polipeptidlerin 8-10 metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim için bilinen 11 Tud alanları içerir.
Daha önce, fonksiyonel Tud 5 HA-etiketli ifade eder ve bu nedenle, spesifik bir anti-HA antikoru çapraz bağlamadan sonra Tud kompleksi aşağı çekmek için kullanılan bir transgenik Drosophila satır elde ettik.
Protein-protein çapraz bağlar ek olarak, nükleik asit, formaldehit-protein çapraz bağlar oluşturabilir ve yonga-seq deneylerde kullanılır. Ayrıca, Drosophila, formaldehid ile çapraz bağlama, in vivo Vasa RNA helikaz protein 11 bir RNA hedefinin belirlenmesini sağladı.
Bu yazıda in vivo çapraz bağlama ve pur için bir yöntem tarif ederkenDrosophila embriyolardan protein kompleksleri ification, bu yöntem diğer organizmalar ve dokular için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formaldehit genellikle protein-protein, protein-nükleik asit etkileşimleri belirlemek için bir çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Birlikte aşağı kütle spektrometresi prosedürleri ile uyumluluğu ile iyi çözünürlük ve hücre zarı geçirgenliği, hücre içi çapraz uygulamalar 3,15-17 için formaldehit ideal bir aday ajan olun. Özel olarak, başarılı bir şekilde Vasa, Drosophila 11 önemli bir germ hücre RNA helikaz ile ilişkili mRNA tespit etmek için k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu çalışma ile teknik yardım için Ürdün Davis, Yanyan Lin, Eric SCHADLER ve Jimiao Zheng teşekkür ederim. Bu çalışma ALA MCB-1054962 hibe NSF KARİYER tarafından desteklenen
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694 (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
