Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones
Summary
Complejos de proteínas con múltiples componentes juegan un papel crucial durante la función y el desarrollo celular. Aquí se describe un método usado para aislar los complejos de proteínas nativas a partir de embriones de Drosophila después de la reticulación en vivo seguido de la purificación de los complejos reticulados para el análisis de estructura-función subsiguiente.
Abstract
Muchos procesos celulares están controlados por complejos de proteínas con múltiples subunidades. Frecuentemente, estos complejos se forman transitoriamente y requieren entorno nativo de montar. Por lo tanto, para identificar estos complejos de proteínas funcionales, es importante para estabilizar ellos in vivo antes de la lisis celular y la posterior purificación. Aquí se describe un método para aislar grandes complejos de proteínas de buena fe a partir de embriones de Drosophila. Este método se basa en la permeabilización del embrión y la estabilización de los complejos dentro de los embriones de reticulación en vivo usando una baja concentración de formaldehído, que puede atravesar fácilmente la membrana celular. Posteriormente, el complejo proteína de interés se inmunopurificó seguido por purificación en gel y se analizaron por espectrometría de masas. Se ilustra este método mediante la purificación de un complejo de proteínas de Tudor, que es esencial para el desarrollo de la línea germinal. Tudor es una proteína grande, que contiene varios dominios Tudor – pequeñamódulos que interactúan con argininas metiladas o lisinas de las proteínas diana. Este método puede adaptarse para el aislamiento de complejos de proteínas nativas de diferentes organismos y tejidos.
Introduction
El aislamiento de las asambleas de proteínas y complejos de múltiples subunidades de ADN o ARN-proteína se realiza para identificar los complejos de proteínas, genómica loci reconocida por proteínas reguladoras se unen al ADN o ARN objetivos de las proteínas de unión de ARN. Diferentes métodos permiten la identificación de todo el genoma de ADN sitios reconocidos por factores de transcripción o proteínas de la cromatina (ChIP-seq) 1 y los objetivos de ARN asociados con una proteína de unión al ARN dado (CLIP-seq) 2. Las bibliotecas de ADNc de ARN derivados u objetivos de ADN son entonces profundamente secuenciados. Estos métodos utilizan química o reticulación para estabilizar los complejos seguido por inmunoprecipitación (IP) con un anticuerpo contra un componente de proteína del complejo estudiado inducida por UV.
Durante el desarrollo de un organismo, muchos complejos de proteínas forman transitoriamente. Por lo tanto, es crucial para analizar la composición y función de estos complejos in vivo para comprender los mecanismos moleculares que controlan development. Tal análisis in vivo sería superior a enfoque in vitro, ya que es prácticamente imposible de reproducir concentraciones nativas de los componentes que interactúan y entorno bioquímico celular in vitro. Aquí se demuestra un enfoque in vivo que utilizamos con éxito para aislar grandes complejos de proteínas a partir de embriones de Drosophila. En este método, los complejos de proteínas en los embriones vivos se reticulan con una baja concentración de formaldehído y, posteriormente, los complejos de proteínas de interés se aíslan por IP con un anticuerpo contra un componente conocido de los complejos seguido de purificación en gel de los complejos y el análisis de espectrometría de masas para identificar los componentes complejos desconocidos. Dado que el formaldehído es capaz de permear la membrana de la célula y tiene un rango de reticulación de 2.3 a 2.7 Å 3, los complejos de proteínas se pueden reticular in vivo y los componentes complejos son propensos a estar cerca el uno al otro. En este artículodescribir este método usando el aislamiento de entramado (Tud) complejo de la proteína como un ejemplo. Tud es una proteína de la línea germinal que es esencial para el desarrollo de la línea germinal 4-7. Esta proteína contiene 11 dominios TUD conocidos para interactuar con argininas metiladas o lisinas de otros polipéptidos 8-10.
Anteriormente, hemos generado una línea de Drosophila transgénica que expresa HA-etiquetados funcional Tud 5 y por lo tanto, el anticuerpo específico anti-HA se utiliza para tirar hacia abajo compleja Tud después de la reticulación.
Además de reticulaciones proteína-proteína, el formaldehído puede generar enlaces cruzados de proteína-ácido nucleico y se utiliza en los experimentos de ChIP-ss. Además, en Drosophila, in vivo de reticulación con formaldehído ha permitido la identificación de una diana de ARN de la proteína helicasa Vasa ARN 11.
Aunque en este artículo se describe un método para la reticulación in vivo y purficación de complejos de proteínas a partir de embriones de Drosophila, este método se puede adaptar para otros organismos y tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El formaldehído se ha usado comúnmente como un reactivo de reticulación para la identificación de proteína-proteína y las interacciones proteína-ácido nucleico. Su buena solubilidad y permeabilidad de la membrana celular, junto con la compatibilidad con los procedimientos de espectrometría de masas aguas abajo, crea formaldehído un agente candidato ideal para aplicaciones de reticulación intracelulares 3,15-17. En particular, se utiliza con éxito para identificar los ARNm asociados con Vasa, una h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler y Jimiao Zheng por su ayuda técnica con este estudio. Este trabajo fue apoyado por NSF CARRERA conceder MCB-1054962 de ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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