En In vivo Crosslinking Approach å isolere protein komplekser Fra Drosophila Embryo
Summary
Multikomponent proteinkomplekser spiller avgjørende roller i cellulær funksjon og utvikling. Her beskriver vi en fremgangsmåte til å isolere opprinnelige proteinkomplekser fra Drosophila embryo etter in vivo tverrbinding etterfulgt av rensing av de tverrbundne komplekser for etterfølgende struktur-funksjonsanalyse.
Abstract
Mange cellulære prosesser som er styrt av multisubunit proteinkomplekser. Ofte disse kompleksene danne forbigående og krever opprinnelige miljø å montere. Derfor, for å identifisere disse funksjonelle proteinkomplekser, er det viktig for å stabilisere dem in vivo før cellelysering, og etterfølgende rensing. Her beskriver vi en metode som brukes for å isolere store bona fide protein komplekser fra Drosophila embryoer. Denne metoden er basert på embryo permeabilization og stabilisering av de komplekser inne i embryoer ved in vivo tverrbinding ved hjelp av en lav konsentrasjon av formaldehyd, noe som lett kan krysse cellemembranen. Deretter blir proteinkompleks av interesse immunopurified etterfulgt av gel-rensing og analysert ved massespektrometri. Vi illustrerer denne fremgangsmåte ved hjelp av rensing av et Tudor proteinkompleks, som er avgjørende for kimlinje utvikling. Tudor er et stort protein, som inneholder flere Tudor domener – litenmoduler som samhandler med denaturert arginines eller lysines av target proteiner. Denne fremgangsmåte kan tilpasses for isolering av fremmedproteinkomplekser fra forskjellige organismer og vev.
Introduction
Isolering av multisubunit proteinsammensetningene og DNA-eller RNA-proteinkomplekser er utført for å identifisere proteinkomplekser, genomiske loci gjenkjent av DNA-bindende regulatoriske proteiner eller RNA-mål på RNA-bindende proteiner. Ulike metoder tillate genome-wide identifikasjon av DNA sider anerkjent av transkripsjonsfaktorer eller kromatin proteiner (chip-SEQ) for en og RNA mål knyttet til en gitt RNA-bindende protein (CLIP-seq) 2. Bibliotekene av RNA-avledet cDNAs eller DNA målene blir så dypt sekvensert. Disse metodene brukes kjemiske eller UV-indusert tverrbinding for å stabilisere komplekser fulgt av immunoutfelling (IP) med et antistoff mot et protein-komponenten av de studerte kompleks.
Under utvikling av en organisme, mange protein-komplekser dannes forbigående. Derfor er det viktig å analysere sammensetningen og funksjonen til disse kompleksene in vivo for å forstå de molekylære mekanismer som styrer development. En slik in vivo-analyse ville være overlegne i forhold til in vitro metode siden det er praktisk talt umulig å reprodusere opprinnelige konsentrasjoner av de samvirkende komponenter og cellulær biokjemiske miljø in vitro. Her viser vi en in vivo tilnærming som vi lykkes med å bruke til å isolere store proteinkomplekser fra Drosophila embryoer. I denne metoden, blir proteinkomplekser i de levende embryoer tverrbundet med en lav konsentrasjon av formaldehyd og etterfølgende protein-komplekser av interesse blir isolert ved IP med et antistoff mot en kjent komponent av kompleksene, etterfulgt av gel-rensing av kompleksene og massespektrometri-analyse til identifisere ukjente komplekse komponenter. Siden formaldehyd er i stand til å trenge gjennom cellemembranen og har et tverrbindingsområde av 2,3 til 2,7 Å. 3, kan proteinkomplekser kan fornettes in vivo, og de komplekse komponenter er sannsynlig å være nær hverandre. I denne artikkelen har vibeskrive denne metode med bruk av isolering av Tudor (Tud) protein-komplekset som et eksempel. Tud er en kimlinje protein som er essensielt for utvikling av kimlinje 4-7. Dette proteinet inneholder 11 Tud domener som interagerer med denaturert arginines eller lysines av andre polypeptider 8-10.
Tidligere har vi generert en transgen Drosophila linje som uttrykker HA-merket funksjonell Tud 5 og derfor er spesifikk anti-HA antistoff brukes til å trekke ned Tud kompleks etter kryssbinding.
I tillegg til protein-protein-tverrbindinger, kan formaldehyd generere nukleinsyre-protein-tverrbindinger, og som brukes i chip-seq eksperimenter. Videre, i Drosophila, in vivo kryssbinding med formaldehyd har muliggjort identifisering av en RNA target for Vasa RNA helicase protein 11.
Mens i denne artikkelen beskriver vi en metode for in vivo kryssbinding og purification av protein komplekser fra Drosophila embryo, kan denne metoden være tilrettelagt for andre organismer og vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formaldehyd har blitt vanlig benyttet som kryssbindings reagens for å identifisere protein-protein og protein-nukleinsyre interaksjoner. Dens god oppløselighet og cellemembranen permeabilitet, sammen med kompatibiliteten med nedstrøms massespektrometri prosedyrer, gjør formaldehyd en ideell kandidat agent for intracellulære crosslinking applikasjoner 3,15-17. Spesielt ble det med hell brukes til å identifisere mRNA forbundet med Vasa, en kritisk bakterie celle RNA heli i Drosophila 11.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler og Jimiao Zheng for deres teknisk hjelp med denne studien. Dette arbeidet ble støttet av NSF KARRIERE gi MCB-1054962 til ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694 (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
