L'utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host
Summary
La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.
Abstract
La risposta immunitaria agli agenti patogeni è un processo biologico complesso. La maggior parte degli studi in vivo impiegato classico per caratterizzare le interazioni ospite-patogeno approfittano di iniezioni intraperitoneali di selezionare batteri o modelli molecolari patogeni associati (PAMPs) nei topi. Anche se queste tecniche hanno prodotto dati enormi associati con infettiva patobiologia malattia, modelli iniezione intraperitoneale non sono sempre appropriati per studi di interazione ospite-patogeno nel polmone. Utilizzando un polmone modello infiammazione acuta nel topo, è possibile condurre una analisi ad alta risoluzione della risposta immunitaria innata utilizzando lipopolisaccaride (LPS). Qui, descriviamo i metodi per amministrare LPS utilizzando chirurgico orofaringea somministrazione endotracheale, monitorare i parametri clinici associati alla patogenesi della malattia, e utilizzare liquido di lavaggio broncoalveolare di valutare la risposta immunitaria dell'ospite. Le tecniche descrittesono ampiamente applicabile per studiare l'host innata risposta immunitaria ad una gamma diversificata di PAMPs e patogeni. Analogamente, con piccole modifiche, queste tecniche possono essere applicate anche in studi che valutano allergica infiammazione delle vie aeree e nelle applicazioni farmacologiche.
Introduction
Infezioni polmonari associate a batteri patogeni specie sono una causa comune di morbilità e mortalità a livello mondiale. Determinare i meccanismi che guidano la risposta immunitaria a questi agenti patogeni promuoverà lo sviluppo di strategie di prevenzione e nuovi agenti terapeutici che attenuare l'impatto di queste infezioni. L'obiettivo generale del protocollo qui descritto è di fornire all'utente un metodo flessibile per valutare l'host risposta immunitaria innata all'infezione patogeno utilizzando un modello patogeno associato molecolare (PAMP) come surrogato batteri vivi. La maggior parte degli studi precedenti che valutano l'host innata risposta immunitaria ai batteri si sono concentrati su modelli peritoneali causa della relativa facilità di esecuzione. Anche se questi modelli sono molto utili e hanno portato a significativi progressi nel campo delle interazioni ospite-patogeno e infiammazione sistemica, i dati generati da questi modelli non sono sempre appropriati per gli studi involving il sistema respiratorio. Qui, un modello polmonare di infiammazione polmonare acuta si propone come un ampliamento pratico e clinicamente rilevante delle intraperitoneale (ip) modelli ad iniezione classici. La tecnica proposta consente la valutazione locale della risposta immunitaria innata in un sistema modello specifico organo.
I metodi qui descritti sono progettati per fornire una tecnica semplice e robusto per consentire agli utenti di valutare la risposta immunitaria a LPS, che è un PAMP comune. I metodi sono basati su endotracheale (it) instillazione di LPS, che induce una risposta immunitaria innata robusto nei polmoni dei topi e imita molte delle caratteristiche fisiopatologiche osservate in pazienti umani affetti da infezioni respiratorie e danno polmonare acuto 1. Un vantaggio principale di questa tecnica è che permette all'utente di valutare la risposta immunitaria senza i fattori di confusione e problemi di sicurezza associati alla realizzazione di studi in vivoutilizzando batteri vivi. Allo stesso modo, la via orofaringea che la somministrazione di esposizione descritto in questo protocollo ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate, tra cui intranasale (in) amministrazione e l'amministrazione è chirurgica. Ad esempio, la somministrazione è orofaringea permette dosaggio in vasca relativamente accurato e deposizione polmonare rispetto al somministrazione, che soffre tipicamente da una maggiore variabilità di deposizione polmonare dovuta alla perdita di agenti nella cavità nasale e dei seni 2-4. L'instradamento somministrazione elude queste cavità e consente l'accesso diretto alla trachea e vie aeree. Allo stesso modo, l'approccio chirurgico si tratta di un metodo di gestione molto più morboso e richiede una formazione da padroneggiare. I protocolli descritti qui includono anche una descrizione delle tecniche più comuni e marcatori surrogati utilizzati per valutare la progressione infiammazione e terminare con un protocollo che descrive le tecniche adeguate per la preparazione del luNGS per la valutazione istopatologica. Questi protocolli sono focalizzati sulla riduzione del numero di topi richiesti per ciascuno studio massimizzando i dati generati da ogni singolo animale.
I protocolli descritti sono estremamente flessibili e possono essere facilmente modificati per valutare una diversa PAMPs gamma e modelli molecolari di danno associato (smorza). Inoltre, con alcune modifiche supplementari, questi protocolli possono essere applicati anche a studi che hanno valutato la progressione della malattia delle vie respiratorie allergiche o interazioni ospite-patogeno con batteri vivi, virus o funghi 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici per valutare correttamente la risposta immunitaria nei polmoni del mouse è il seguente: 1) scegliere il ceppo del mouse appropriato e sesso per il modello in corso di valutazione; 2) ottimizzare la consegna PAMP ai polmoni; 3) raccogliere ed elaborare correttamente il BALF; e 4) correttamente correggere e preparare i polmoni per le valutazioni istopatologiche.
La scelta del ceppo di topo è un fattore importante per la valutazione della risposta immunitaria dell'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Regional College VA-MD di medicina veterinaria per fornire assistenza di base e tecnico per questo progetto. Questo lavoro è supportato da un NIH Career Development Award (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
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