마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용
Summary
병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.
Abstract
병원체에 대한 숙주 면역 반응은 복잡한 생물학적 과정이다. 생체 내 연구의 대부분은 고전적인 호스트 병원체 상호 작용이 생쥐를 선택 세균이나 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 복강 내 주사의 장점을 특성화하기 위해 사용. 이러한 기술은 감염증 한테 진찰 Pathobiology와 관련된 엄청난 데이터를 산출하고 있지만, 복강 내 주사 모델은 항상 폐에 호스트 병원체 상호 작용 연구에 적합하지 않다. 생쥐의 급성 폐 염증 모델을 이용해서, 그 선천적 면역 반응은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)를 이용하여 호스트의 고해상도 분석을 수행 할 수있다. 여기서는, 비수술 인두 기관 내 투여를 이용하여 LPS를 관리 질병 병인과 관련된 임상 매개 변수를 모니터링하고, 숙주 면역 반응을 평가하기 위해 기관지 세정액을 활용하는 방법을 설명한다. 설명하는 기술PAMPS 및 병원균의 다양한 범위에 호스트 타고난 면역 반응을 연구하는데 널리 적용 할 수있다. 마찬가지로, 약간의 수정과 함께, 이들 기술은 또한 알레르기 성기도 염증을 평가 연구 및 약리학 애플리케이션에 적용될 수있다.
Introduction
병원성 박테리아 종과 관련된 폐 감염은 글로벌 병적 상태와 사망률의 흔한 원인이다. 이들 병원균에 대한 숙주 면역 반응을 구동 메커니즘을 결정하는 것은 이러한 감염의 영향을 약하게 할 신규 예방 전략 및 치료제의 개발을 촉진 할 것이다. 여기에 설명 된 프로토콜의 전반적인 목표는 생균에 대한 대리 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)를 사용하여 병원균 감염에 대한 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 위해 유연한 방식으로 사용자에게 제공하는 것이다. 박테리아 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 이전 연구의 대부분은 의한 실행의 상대적 용이성 복막 모델에 초점을 맞추고있다. 이 모델은 매우 유용하고 호스트 병원체 상호 작용과 전신 염증의 분야에서 상당한 발전시킬 수도 있지만,이 모델에서 생성 된 데이터는 항상 연구에 적합하지 involvi호흡기를 겨. 여기서, 급성 폐 염증의 폐 모델은 고전 복강 내 (IP) 주입 모델과 실제 임상 적으로 관련된 확장으로서 제안되어있다. 제안 된 기술은 특정 장기 모델 시스템에서의 선천성 면역 반응의 평가를 위해 로컬 허용한다.
여기서 설명한 방법은 사용자가 공통 PAMP이다 LPS에 숙주 면역 반응을 평가할 수있는 간단하고 강력한 기술을 제공하도록 설계된다. 방법은 기관 내 마우스 및 호흡기 질환 및 급성 폐 손상 1에서 고통받는 인간의 환자에서 관찰되는 병리 생리 학적 기능의 많은 모방의 폐에 강력한 선천성 면역 반응을 유도 LPS의 (IT) 점안을 기반으로합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 생체 내 연구에서 수행과 관련된 교란 변수 및 안전 우려없이 숙주 면역 반응을 평가할 수 있다는 것이다살아있는 박테리아를 사용하여. 마찬가지로,이 프로토콜에 설명 된 노출의 인두 IT 관리 경로 관리 (의) 비강 수술 IT 관리 등 다른 일반적으로 사용 기술에 비해 상당한 장점이 있습니다. 예를 들어, 인두 IT 관리는 일반적으로 인해 비강에있는 에이전트의 손실로 폐 증착의 변동성이 증가 시달리고 2-4 부비동 관리,의에 비해 상대적으로 정확한 dosaging과 폐 증착 할 수 있습니다. 그것의 투여 경로는 이러한 충치를 우회하고 기관과기도에 직접 액세스 할 수 있습니다. 마찬가지로, 수술의 IT 접근 방식은 훨씬 더 병적 관리 방법 및 마스터에 광범위한 교육이 필요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 또한 일반적인 기술 및 염증의 진행을 평가하고 LU를 제조하는데 적절한 기술을 설명하는 프로토콜을 종료하는 데 사용되는 대리 마커 설명을 포함조직 병리학 평가를위한 NGS. 이러한 프로토콜은 각각의 동물에서 생성 된 데이터를 최대화함으로써 각각의 연구에 필요한 생쥐의 수를 최소화하는 데 초점을 맞추고있다.
설명하는 프로토콜은 매우 유연하고 쉽게 다양한 범위의 PAMPS 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)을 평가하기 위해 수정 될 수 있습니다. 또한, 몇 가지 추가 수정,이 프로토콜은 또한 알레르기 성기도 질환의 진행 또는 살아있는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 5-10와 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 연구에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음과 같이 성공적으로 마우스의 폐에서 호스트 면역 반응을 평가하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 평가중인 모델에 대한 적절한 마우스 긴장과 섹스를 선택; 2) 폐에 PAMP 전달을 최적화; 3) 제대로 수집하고 BALF를 처리; 4) 제대로 해결 및 조직 병리학 적 평가를위한 폐의 준비.
마우스 균주의 선택은 숙주의 면역 반응을 평가하는 중요한 요소이다. C57BL / 6 마?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로젝트의 핵심 및 기술 지원을 제공하는 동물 용 의약품의 VA-MD 지역 대학 감사합니다. 이 작품은 NIH 경력 개발 상 (K01DK092355)에 의해 지원된다.
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
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