La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones
Summary
La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.
Abstract
La respuesta inmune del huésped a patógenos es un proceso biológico complejo. La mayoría de los estudios in vivo empleado clásicamente para caracterizar las interacciones huésped-patógeno se aprovechan de inyecciones intraperitoneales de seleccionar las bacterias o los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en ratones. Si bien estas técnicas han rendido enormes de datos relacionados con patobiología enfermedad infecciosa, los modelos de inyección intraperitoneal no siempre son apropiadas para estudios de interacción huésped-patógeno en el pulmón. Utilizando un modelo de inflamación pulmonar aguda en ratones, es posible llevar a cabo un análisis de alta resolución de la respuesta inmune del huésped innata la utilización de lipopolisacárido (LPS). A continuación, describimos los métodos para administrar el uso de la administración intratraqueal LPS orofaríngea no quirúrgico, el seguimiento de parámetros clínicos asociados con la patogénesis de la enfermedad, y utilizar el líquido de lavado broncoalveolar para evaluar la respuesta inmune del huésped. Las técnicas que se describenson ampliamente aplicables para el estudio de la respuesta inmune innata de acogida a un rango diverso de PAMP y patógenos. Del mismo modo, con pequeñas modificaciones, estas técnicas pueden también ser aplicadas en los estudios que evalúan la inflamación de las vías respiratorias alérgica y en aplicaciones farmacológicas.
Introduction
Las infecciones pulmonares asociadas a especies de bacterias patógenas son una causa frecuente de morbilidad y mortalidad global. La determinación de los mecanismos que conducen a la respuesta inmune del huésped a estos patógenos, promoverá el desarrollo de estrategias de prevención novedosas y agentes terapéuticos que atenuar el impacto de estas infecciones. El objetivo general del protocolo descrito aquí es proporcionar al usuario un método flexible para evaluar la respuesta inmune innata huésped a la infección del patógeno utilizando un patrón molecular asociado patógeno (PAMP) como un sustituto de bacterias vivas. La mayoría de los estudios previos de evaluación de la respuesta inmune innata de acogida a las bacterias se han centrado en modelos peritoneales debido a la relativa facilidad de ejecución. Aunque estos modelos son muy útiles y han dado lugar a avances significativos en el campo de las interacciones huésped-patógeno y la inflamación sistémica, los datos generados a partir de estos modelos no siempre son apropiadas para estudios involving el sistema respiratorio. Aquí, un modelo pulmonar de la inflamación pulmonar aguda se propone como una expansión práctico y clínicamente relevante de los modelos de inyección clásicos intraperitoneal (ip). La técnica propuesta permite la evaluación local de la respuesta inmune innata en un sistema de modelo específico de órganos.
Los métodos descritos aquí se han diseñado para proporcionar una técnica simple y robusto para permitir a los usuarios evaluar la respuesta inmune del huésped a LPS, que es un PAMP común. Los métodos se basan en intratraqueal (IT) de la instilación de LPS, que induce una respuesta inmune innata robusto en los pulmones de los ratones y imita muchas de las características fisiopatológicas observadas en los pacientes humanos que sufren de infecciones respiratorias y la lesión pulmonar aguda 1. Una ventaja principal de esta técnica es que permite al usuario evaluar la respuesta inmune del huésped y sin los factores de confusión y problemas de seguridad asociados con la realización de estudios in vivoel uso de bacterias vivas. Del mismo modo, la vía de administración que orofaríngea de la exposición descrita en este protocolo tiene ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas, incluyendo intranasal (in) administración y gestión se quirúrgico. Por ejemplo, la administración que orofaríngea permite la dosificación relativamente precisa y la deposición de pulmón en comparación con en la administración, que típicamente sufre de aumento de la variabilidad de la deposición en los pulmones debido a la pérdida de agentes en la cavidad nasal y los senos paranasales 2-4. La vía de administración, elude estas cavidades y permite el acceso directo a la tráquea y las vías respiratorias. Del mismo modo, el enfoque que se quirúrgica es un método de administración mucho más morboso y requiere una amplia formación de dominar. Los protocolos descritos aquí también incluyen una descripción de las técnicas comunes y marcadores indirectos utilizados para evaluar la progresión de la inflamación y terminar con un protocolo que describe las técnicas adecuadas para la preparación de la luones para las evaluaciones de histopatología. Estos protocolos se centran en reducir al mínimo el número de ratones requeridos para cada estudio mediante la maximización de los datos generados a partir de cada animal individual.
Los protocolos descritos son altamente flexibles y pueden ser fácilmente modificados para evaluar una diversa gama PAMPs y los daños asociados a patrones moleculares (apaga). Por otra parte, con algunas modificaciones, estos protocolos también pueden ser aplicados a los estudios que evalúan la progresión de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas o interacciones huésped-patógeno con bacterias vivas, virus u hongos 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes para evaluar con éxito la respuesta inmune del huésped en los pulmones del ratón es el siguiente: 1) elegir la cepa de ratón apropiado y sexo para el modelo que se está evaluando; 2) optimizar la entrega de PAMP a los pulmones; 3) recopilar y procesar correctamente la BALF; y 4) fijan correctamente y preparar los pulmones para las evaluaciones histopatológicas.
La elección de la cepa de ratón es un factor importante en la evaluación de la respuesta inmune …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Universidad Regional del VA-MD de la medicina veterinaria para proporcionar núcleo y soporte técnico para este proyecto. Este trabajo es apoyado por un premio de Desarrollo Profesional de los NIH (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
