Использование ротоглотки интратрахеального PAMP администрации и бронхоальвеолярного лаважа для оценки иммунного ответа хозяина у мышей
Summary
Хозяин иммунный ответ на возбудителя инфекции является жестко регулируется процесс. Используя легких модель экспозиции липополисахарида у мышей, можно проводить оценки с высоким разрешением сложных механизмов, связанных с патогенезе заболевания.
Abstract
Хозяин иммунный ответ на патогены является сложным биологическим процессом. Большинство естественных условиях исследования в классически используется для характеристики хост-патогенные взаимодействия воспользоваться внутрибрюшинных инъекций выберите бактерий или патогенных связанные молекулярные модели (PAMPs) у мышей. Хотя эти методы дали огромные данные, связанные с инфекционными патобиологии заболевания, внутрибрюшинные модели инъекции не всегда подходят для хост-патогенных исследований взаимодействия в легких. Используя острый воспаление легких у мышей модель, можно проводить анализ с высоким разрешением хоста врожденного иммунного ответа с использованием липополисахарид (LPS). Здесь мы опишем методы для управления ЛПС с помощью нехирургических ротоглотки трахею, контролировать клинические параметры, связанные с патогенезе заболевания, и использовать БАЛ оценить иммунного ответа. Методики, описанныешироко применяются для изучения хоста врожденной иммунной реакции на разнообразных PAMPs и патогенных микроорганизмов. Кроме того, с незначительными изменениями, эти методы могут также применяться в исследований по оценке аллергическое воспаление дыхательных путей и в фармакологических применений.
Introduction
Легочные инфекции, связанные с патогенными бактериями вида являются частой причиной глобального заболеваемости и смертности. Определение механизмов, которые управляют иммунного ответа на эти патогенов будет способствовать развитию новых стратегий профилактики и терапевтических агентов, которые будут уменьшить воздействие этих инфекций. Общая цель протокола, описанного здесь, чтобы предоставить пользователю с гибким методом для оценки хоста врожденной иммунной реакции на возбудителя инфекции с использованием патогенных микроорганизмов, связанное молекулярную модель (PAMP) в качестве суррогата живых бактерий. Большинство предшествующих исследований по оценке хоста врожденной иммунной реакции на бактерии были сосредоточены на перитонеальных моделей из-за относительной легкости исполнения. В то время как эти модели являются очень полезными и привели к значительным достижениям в области хозяин-патоген взаимодействий и системного воспаления, данные, полученные от этих моделей не всегда подходят для исследований involviнг дыхательную систему. Здесь, легочной модели острого воспаления легких, предлагается в качестве практического и клинически значимого расширения классических внутрибрюшинного (IP) моделей инъекций. Предложенный способ позволяет локальной оценки врожденного иммунного ответа в модельной системе конкретного органа.
Методы, описанные здесь были разработаны для обеспечения простой и надежный метод, позволяющий пользователям оценить иммунного ответа на ЛПС, которая является общей ПАМП. Методы основаны на интратрахеального (это) закапывания ЛПС, который вызывает устойчивую врожденную иммунную реакцию в легких мышей и имитирует многих патофизиологических особенностей, наблюдаемых у больных людей, страдающих от респираторных инфекций и острого повреждения легких 1. Основное преимущество этого метода в том, что он позволяет пользователю оценить иммунного ответа без сопутствующих факторов и проблем безопасности, связанных с проведением в естественных условиях исследованияиспользуя живые бактерии. Аналогично, ротоглотки это управление путь воздействия, описанного в данном протоколе имеет значительные преимущества по сравнению с другими обычно используемыми способами, в том числе интраназального (в) введения и введения хирургического он. Например, ротоглотки администрация это позволяет относительно точное дозирование и отложение легких по сравнению с в администрации, которая, как правило, страдает от повышенной изменчивости отложения в легких в связи с потерей средств в полости носа и придаточных пазух 2-4. Маршрут его администрация обходит эти полости и обеспечивает прямой доступ к трахее и дыхательных путей. Кроме того, хирургическое это подход является методом значительно более болезненный администрация и требует серьезной подготовки к хозяину. Протоколы, описанные здесь, также включают в себя описание общих методов и суррогатные маркеры, используемые для оценки прогрессирования воспаления и заканчиваться протокола, описывающего правильные методы для подготовки луNGS для оценки гистопатология. Эти протоколы сосредоточены на минимизации количества мышей, необходимых для каждого исследования путем максимизации данные, полученные от каждого животного.
Протоколы, описанные очень гибкие и могут быть легко изменены, чтобы оценить разнообразную PAMPs дальности и ущерба, связанных молекулярных моделей (DAMPS). Кроме того, с несколькими дополнительными модификациями, эти протоколы могут также применяться для исследований, оценивающих развитие аллергической дыхательных путей заболевания или хост-патогенных взаимодействия с живыми бактериями, вирусами или грибами 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для успешного оценки иммунного ответа в легких мышей выглядит следующим образом: 1) выбрать подходящий штамм мыши и секс для модели оценки; 2) оптимизировать доставку PAMP в легкие; 3) правильно собирать и обрабатывать БАЛ; и 4) правильно зафиксировать и подготовить лег?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят В.А.-MD областного колледжа ветеринарной медицины за предоставление основной и техническую поддержку для этого проекта. Эта работа поддержана NIH Карьера премии развития (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
