Utnyttjandet av orofaryngeal Intratracheal PAMP Administration och lungsköljning för att utvärdera värdimmunsvar hos möss
Summary
Värden immunsvar mot patogenen infektion är en hårt reglerad process. Med hjälp av en lungmodell exponering lipopolysackarid i möss, är det möjligt att utföra högupplösta utvärderingar av de komplexa mekanismer som är förknippade med sjukdomen patogenes.
Abstract
Värden immunsvaret mot patogener är en komplex biologisk process. Majoriteten av in vivo-studier klassiskt används för att karakterisera värd-patogen interaktioner utnyttja intraperitoneala injektioner av utvalda bakterier eller patogen associerade molekylära mönster (PAMPs) i möss. Dessa tekniker har gett enorma uppgifter i samband med infektionssjukdomar pathobiology Medan, intraperitoneal injektion modeller är inte alltid lämpliga värd-patogen interaktionsstudier på lungan. Med hjälp av en akut lunginflammationsmodell i möss, är det möjligt att genomföra en hög upplösning analys av värdens naturliga immunsvar med användning av lipopolysackarid (LPS). Här beskriver vi de metoder för att administrera LPS med användning av icke-kirurgisk orofaryngeal intratrakeal administrering övervaka kliniska parametrar som förknippas med sjukdom patogenes, och använda bronkoalveolär sköljvätska för att utvärdera värdimmunsvar. De tekniker som finns beskrivnaär allmänt tillämpas för att studera värd medfödda immunsvar på ett varierat utbud av PAMPs och patogener. På samma sätt, med smärre modifikationer, av dessa tekniker kan också användas i studier som utvärderar allergisk luftvägsinflammation och i farmakologiska tillämpningar.
Introduction
Lunginfektioner i samband med patogena bakterier arter är en vanlig orsak till global sjuklighet och dödlighet. Fastställande av mekanismer som driver värd immunsvar mot dessa patogener kommer att främja utvecklingen av nya strategier för förebyggande och terapeutiska medel som dämpar effekterna av dessa infektioner. Det övergripande målet för det protokoll som beskrivs här är att ge användaren en flexibel metod för att utvärdera värd medfödda immunsvar mot patogen infektion med hjälp av en patogen samband molekylära mönster (PAMP) som ett surrogat för levande bakterier. Majoriteten av tidigare studier som utvärderar värd medfödda immunsvar mot bakterier har fokuserat på peritoneal modeller på grund av den relativa lätthet i utförandet. Även om dessa modeller är mycket användbara och har lett till betydande framsteg när det gäller värd-patogen interaktioner och systemisk inflammation, de data som genereras från dessa modeller är inte alltid lämpliga för studier involving andningsorganen. Här används en lungmodell av akut lunginflammation som föreslås som ett praktiskt och kliniskt relevant expansion av de klassiska intraperitoneala (ip) injektion modeller. Den föreslagna tekniken tillåter för den lokala utvärderingen av det medfödda immunsvaret hos en organspecifik modellsystem.
De metoder som beskrivs här är utformade för att ge en enkel och robust teknik för att tillåta användare att utvärdera värd immunsvar mot LPS, vilket är en vanlig PAMP. Metoderna är baserade på intratrakeal (det) instillation av LPS, som inducerar en robust medfödda immunsvaret i lungorna hos möss och härmar många av de patofysiologiska egenskaper som observerats hos människor som lider av luftvägsinfektioner och akut lungskada 1. En primär fördel med denna teknik är att den tillåter användaren att utvärdera värdimmunsvar utan de störfaktorer och säkerhetsbekymmer som är förknippade med att utföra in vivo-studiermed hjälp av levande bakterier. Likaså den orofaryngeal det administrations exponeringsväg som beskrivs i detta protokoll har betydande fördelar jämfört med andra allmänt utnyttjade tekniker, inklusive intranasal (i) administration och kirurgisk den administration. Till exempel tillåter orofaryngeal den administration relativt exakt dosaging och lungdeposition jämfört med i administrationen, som vanligtvis lider av ökad variabilitet lungdeposition på grund av förlusten av agenter i näshålan och bihålor 2-4. I det administreringssätt kringgår dessa håligheter och ger direkt tillgång till luftstrupen och luftvägarna. Likaså är den kirurgiska det synsätt en betydligt mer morbid administreringsmetod och kräver omfattande utbildning till mästare. De protokoll som beskrivs här finns också en beskrivning av de gemensamma tekniker och surrogatmarkörer som används för att bedöma inflammation progression och avslutas med ett protokoll som beskriver rätt teknik för att förbereda lungar för bedömningar histopatologi. Dessa protokoll är inriktade på att minimera antalet möss som krävs för varje studie genom att maximera de data som genereras från varje enskilt djur.
De protokoll som beskrivs är mycket flexibla och kan lätt modifieras för att utvärdera en mängd olika PAMPs och skador i samband molekylära mönster (dämpas). Dessutom med några ytterligare ändringar, dessa protokoll kan också tillämpas på studier som utvärderar allergisk luftvägssjukdomsprogression eller värd-patogen interaktioner med levande bakterier, virus eller svamp 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrikt utvärdera värdens immunsvar i mus lungorna är följande: 1) välja lämplig musstam och kön för modellen som utvärderas; 2) optimera PAMP leverans till lungorna; 3) rätt att samla in och bearbeta BALF; och 4) väl fixa och förbereda i lungorna för histopatologiska bedömningar.
Valet av musstam är en viktig faktor vid utvärdering av värdimmunsvar. C57BL / 6 möss är vanligtvis anses vara den optimala musen bakgrund för att studera med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar VA-MD Regional College of Veterinary medicin för att ge kärna och tekniskt stöd för detta projekt. Detta arbete stöds av en NIH Career Development Award (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
