Роман Растяжка Платформа для приложений в клеточной и тканевой Mechanobiology
Summary
Мы представляем в этой статье новый растяжения платформу, которую можно использовать для исследования одиночных клеточные реакции в сложной анизотропной двухосной механической деформации и количественной оценки механических свойств биологических тканей.
Abstract
Инструменты, которые позволяют применение механических сил в клетках и тканях или которые могут количественно механические свойства биологических тканей резко вклад в понимание фундаментальных mechanobiology. Эти методы широко используются для демонстрации того, как начало и прогрессирование различных заболеваний находятся под сильным влиянием механических сигналов. В данной статье представлен многофункциональный двухосного растяжения (BAXS) платформу на которые могут либо механически стимулировать отдельные клетки или количественно механическую жесткость тканей. Платформа BAXS состоит из четырех звуковой катушки двигателей, которыми можно управлять независимо. Отдельные клетки можно культивировать на гибкой подложке, которую можно присоединить к двигателям, позволяющих одним подвергать клетки к сложным, динамических и пространственно меняющихся полей деформации. С другой стороны, за счет включения нагрузки силой ячейку, можно также количественно механических свойств первичных тканей, которые подвергаются воздействию циклов деформации.В обоих случаях, надлежащий комплект зажимов должны быть спроектированы и установлены на платформе двигателей BAXS для того, чтобы твердо удерживать гибкую подложку или ткани интересов. Платформа BAXS может быть установлен на инвертированный микроскоп одновременно осуществлять проходящем свете и / или визуализации флуоресценции для изучения структурной или биохимической реакции образца при растяжении экспериментов. Эта статья предусматривает экспериментальные детали дизайна и использования платформы BAXS и представляет результаты для одной клетки и целые исследований тканей. Платформа BAXS был использован для измерения деформации ядер в отдельных клеток мыши миобластов в ответ на подложку напряжения и измерить жесткость изолированных аорты мыши. Платформа BAXS является универсальным инструментом, который может быть объединен с различными оптическими микроскопии того, чтобы обеспечить новые mechanobiological идеи на ткани уровней субклеточном, клеточном и вся.
Introduction
Механический микросреда играет важную роль во многих клеточных функций, таких как пролиферация, миграции и дифференциации, которые имеют огромное влияние в разработке и гомеостаза тканей, а также при заболеваниях 1-6. На протяжении многих лет, множество экспериментальных средств были использованы для механически стимулируют клетки или ткани и измерения механических свойств биологических тканей с целью повышения нашего понимания основного mechanobiology и изучения возникновения и прогрессирования заболеваний 6-17. Однако, надо часто основаны на различных экспериментальных устройств для достижения целей конкретного исследования. Данная статья представляет собой единый, многофункциональный, двухосного растяжения (BAXS) платформу, которая позволяет для исследований, которые исследуют роль, которую механические свойства и механические силы играют в биологии в субклеточном до целых масштабах длины ткани. Платформа BAXS позволяет не только для quantificatioн механических свойств изолированных тканей, но также облегчает способность применять простые, сложные, и динамические поля деформации в живых клетках, чтобы понять свои ответы на растяжение, что происходит в естественных условиях. Платформа BAXS также поддерживает способность выполнять живых клеток микроскопии во механических испытаний и возмущений на клетки и ткани.
Платформа BAXS является на заказ аппарат, который может быть использован для изучения влияния деформации подложки на клеточном уровне и выполнять испытания на растяжение на биологические ткани (рис. 1А). Алюминий нагреватель был изготовлен для размещения стандартную антенну 10 см Петри и поддерживать любые физиологические растворы при 37 ° С с помощью контроллера температуры и Kapton нагреватели (рис. 1b). Это BAXS платформа может быть интегрирована на перевернутой фазового контраста и / или флуоресцентного микроскопа и позволяет одновременно томографии (рис. 1в).Вкратце, платформа BAXS состоит из четырех линейных звуковой катушки двигателей из которых движущиеся части, установленные на миниатюрные шаровые линейное движение несущих горками, ориентированных вдоль двух перпендикулярных осей (рис. 1D). Этап линейного позиционирования установлен на каждой из четырех двигателей, чтобы обеспечить вертикальное перемещение зажимного системы, которая будет использоваться (рис. 1E). Положение каждого двигателя контролируется с помощью оптического датчика с разрешением 500 нм (рис. 1F). Все четыре двигателя регулируются независимо с контроллером движения, использующего оптический обратной связи с датчиком для выполнения команды движения (рис. 1 г). Интерфейс LabVIEW предоставляет полный контроль над величиной смещения, скорости и ускорения каждого двигателя в целях получения полностью настраиваемый, статическую и динамическую, деформацию клеток или образцов ткани.
Техника используется, чтобы вызвать деформацию в клетках достигается простым allowinг клеток твердо придерживаться гибкой и прозрачной подложке, а затем растяжение этот субстрат с помощью четырех двигателей платформы BAXS. Платформа BAXS позволяет устанавливать любой специально разработанный набор хомутов прикрепить основу на звуковой катушки двигателей. С этой целью мы разработали множество зажимов, к которой гибкая и прозрачная подложка, изготовленная из полидиметилсилоксана (ПДМС), могут быть прикреплены (2а-с и рис. 3). Поскольку зажимы будут подвергаться воздействию физиологических растворах, все части были изготовлены из нержавеющей стали, чтобы обеспечить стерилизации. Эти зажимы были тщательно разработаны, чтобы принести подложку как можно ближе к объектива микроскопа для повышения качества изображения при минимизации стресса на подложке при растяжении (рис. 2, г).
То же самое BAXS платформа может также использоваться для количественного определения жесткости маленькие образцы ткани, используя соответствующий набор зажимов с ADAPТед опоры для образцов ткани и клетки нагрузки для мониторинга силы. Несколько подходов могут быть приняты, чтобы смонтировать ткани платформы двигателей BAXS; в этом случае нержавеющей стали minutiens насекомых штифты можно подключить через отверстие сосудистых тканей для выполнения испытания на растяжение (фиг. 4A-B). Кроме того, для толстых тканей без естественное отверстие, ткани края могут быть на руках в положении с помощью зажимов, прикрепленных к звуковой катушки двигателей или приклеенных к маленькие стеклянные слайды с биологической клея и приложенных к двигателям с зажимами. Для выполнения испытания на растяжение требуется миниатюрный датчик нагрузки и могут быть легко включены на платформу двигателей BAXS и используется для измерения силы, действующей на ткани при растяжении цикла (фиг.4С). Поскольку платформа BAXS состоит из четырех двигателей, введение второго тензодатчика позволяет выполнять испытания на растяжение вдоль двух ортогональных направлениях. Эта способность позволяет quantifу механическое жесткость одной ткани вдоль двух перпендикулярных направлениях в течение того же эксперимента.
Важно отметить, что во всех конфигураций, клетки или образцы ткани, представляющие интерес, всегда поддерживается в контролируемой температурой бане, доступной для пользователя. Эта способность позволяет для введения фармакологических средств во время выборки растяжения с целью изучения временного отклика образца. Кроме того, как оптическая ось инвертированного микроскопа остается беспрепятственно, все формы микроскопии по-прежнему доступны для пользователя. Наконец, так как все четыре двигатели платформы BAXS независимы можно применить настраиваемый полей деформации в образце, представляющего интерес. В естественных клеток и тканей подвергаются сложным и анизотропной растяжения, которые могут быть более соответствующим образом имитируется в этой платформе, в отличие к традиционному одноосного растяжения платформы 7,13,15,18,19. Кроме того, физические характеристикиполя деформаций может быть изменен на лету во время эксперимента. Эти способности позволяют пользователю исследовать клеточный и тканевом уровне ответ на широком ряде весьма сложной, анизотропной, временно, и пространственно меняющихся полей деформации. В этой статье описаны преимущества и ограничения платформы BAXS а также его дизайн, принцип работы, и экспериментальные данные для одной клетки и экспериментов целых тканей.
Рисунок 1. Обзор платформы BAXS. А) Вид сверху на платформе BAXS показывая четыре звуковой катушки двигателей. Б) детальную картину блюдо нагревателя Петри, используемой для поддержания клеток и тканей при температуре 37 ° C. C) Платформа может быть установлен на инвертированный микроскоп выступать с концертами- изображений клеток при растяжения экспериментов.D) Подробная картину двигателя звуковой катушки; подвижная часть платформы. Е) детальную картину сцены линейная позиционирования, позволяющей вертикальное перемещение зажимных систем. F) детальную картину оптического датчика, который обеспечивает в режиме реального времени положение двигателя в контроллер управления движением. G) детальную картину контроллера движения показывая четыре входа оптических датчиков и выходные мощности к четырем звуковой катушки двигателей.
Рисунок 2. Зажима для экспериментов клетки растяжения. AB) Фотографии, показывающие детали зажимов, используемых для крепления PDMS подложки звуковой катушки двигателей для растяжки. C) Субстрат оборачивают вокруг цилиндрической части зажима с его крепежной FeaturES сидит в канавке в верхней части. Затем подложка прикреплена с помощью винтов, которые толкают субстрат / якорь особенности в верхний паз. D) Иллюстрация платформы BAXS с зажимами проведение субстрат на месте. На вставке подробный вид подложки с клетки, прикрепленные к ней сидит чуть выше покровным стеклом и объектива микроскопа.
Рисунок 3. Ведомость материалов мембраны и ее системы зажима. Рисунки, показывающие размеры главных частей интегрированы в двухосной платформы для проведения экспериментов клетки растяжения.
Рисунок 4. Эксдостаточно зажимного системы оценки жесткости мелких сосудов калибра. AB) детальные снимки зажимного системы, используемой, чтобы вызвать деформацию в 1 мм аорты диаметр мыши. Штифты из нержавеющей стали были тщательно формируется в открытых треугольников разрешить судну скользить по обе булавки. C) Иллюстрация платформе BAXS с зажимы держала сосуд и датчик нагрузки, прикрепленный между неподвижным двигателем и левой зажима. На вставке показан детальный вид сверху судна, установленного на штифтов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Платформа BAXS представленные здесь облегчает многочисленные эксперименты в изучении mechanobiology, из исследований отдельных клеток до целых тканей. Кроме того, платформа является очень гибким и настраиваемым, что позволяет многочисленным механических экспериментов стимуляции и многоосн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DT поддержали докторской студенчества от Ле Fonds по исследованиям Квебека-природе ET технологий (FQRNT) и MITACS Elevate стратегического стипендий. CMC поддержали докторской студенчества от ле Fonds по исследованиям ан Санте Квебека (FRSQ) и Эрнеста и Маргарет Форд кардиологии наделен исследований общения из Университета Оттавы института сердца. EOB поддержали операционной грантов MOP80204 от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) и T6335 от сердца и инсульта Фонда Онтарио. CIHR и Medtronic коллективно обеспечить EOB с рецензируемом заведующая кафедрой (УРК # 57093). AEP финансируется естественных и технических наук исследовательский совет (NSERC) Discovery Грант, в Приложении NSERC Discovery Accelerator и благодарит за поддержку научно-исследовательской кафедр Канада программы (КПР) и раннего премии исследователь из провинции Онтарио.
Materials
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S – 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0,20mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28V flexible heaters; can be supplied with a 24V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0,05% | Hyclone | SH30236,02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/ 5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
References
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
- Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
- Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
- Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
- Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
- Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
- Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
- Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
- Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
- Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
- Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
- Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
- Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
- Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
- Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
- Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
- Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
- Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
- Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
- Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
- Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
- Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
- Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
- Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
- Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
- Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
- Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
- Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
- Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).
