Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Summary

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Abstract

Säugetiere nicht in sensorischen und motorischen Erholung nach einer Rückenmarksverletzung aufgrund des Fehlens von axonalen Nachwachsen unter dem Niveau von Verletzungen sowie die Unfähigkeit, Rückenneurogenese wieder aufzunehmen. Doch einige anamniotes einschließlich der Zebrafisch Danio rerio Ausstellung auch nach der kompletten Durchtrennung des Rückenmarks sowohl sensorische und funktionelle Wiederherstellung. Die erwachsenen Zebrafisch ist ein Modellorganismus für das Studium Regeneration nach Rückenmarksverletzungen, mit sensorischen und motorischen Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der in vivo Analyse der Regenerationsprozess in der transparenten Larven Zebrafisch als auch genetische Werkzeuge nicht in der Erwachsenen zugänglich zu machen, verwenden wir die Zebrafisch-Larven, um die Regeneration nach Rückenmarksdurchtrennung zu studieren. Hier zeigen wir ein Verfahren zur reproduzierbar und nachweisbar Trennung des Larvenrückenmark. Nach Durchtrennung, zeigt unsere Daten sensorischen Erholung Anfang mit 2 Tagen nach der Verletzung (dpi), Witzh ist der C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und die Wiederaufnahme des freien Schwimmen von 5 dpi nachweisbar. So schlagen wir die Zebrafisch-Larven als Begleiter Werkzeug an die erwachsenen Zebrafisch für das Studium der Regeneration nach Rückenmarksverletzungen.

Introduction

Schweres Trauma an den menschlichen Rückenmarks oft zu bleibenden Lähmungen und Gefühlsverlust unterhalb der Ebene der Schädigung aufgrund der Unfähigkeit, die Axone wieder wachsen oder reinitiate Genese ^1,2. Im Gegensatz zu Säugetieren, aber anamniotes einschließlich Salamander und Zebrafisch (Danio rerio) zeigen kräftige Erholung auch nach der kompletten Rückenmarksdurchtrennung ^3,4.

Die erwachsenen Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung der Wiederherstellungsprozess folgende Verletzungen des Rückenmarks ^5-7. Nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, ist Wiederherstellung der sensorischen und Lok-Funktion im erwachsenen Zebrafisch von 6 Wochen nach der Verletzung ⁸ beobachtet. Um den Regenerationsprozess in vivo zu untersuchen, wandten wir uns an der transparenten Larven ^{Zebrafisch-9.}

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Rückenmark zu durchtrennen eines 5 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larvenzebrafisch using eine abgeschrägte Mikroinjektionspipette wie ein Skalpell, von Bhatt geändert, et al. ^10. Diese Methode unterstützt hohen Durchsatz, geringe Mortalität und Reproduzierbarkeit. Mit etwas Übung können 300 Larven / h durchtrennt werden, und über 6 Monate von Querschnitten erhalten, darunter mehr als 3.600 Tiere, 98,75% ± 0,72% überlebten bis 7 Tage nach der Verletzung (dpi). Unsere Daten zeigen eine schnelle Wiederherstellung der sensorischen und Fortbewegung als auch: bei 1 dpi, wird jede Bewegung, die der Geschädigte Fisch nur Brustflosse Fortbewegung angetrieben. Allerdings Larven beginnen zu reagieren, um die Nadel zu berühren Schwanztrennung Wolfram von 2 dpi, wiederherzustellen C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und zeigen räuberische Schwimm von 5 ¹¹ dpi. Mit Antikörperfärbung gegen acetyliertes Tubulin haben wir bestätigt, dass Axone fehlen in der Verletzungsstelle bei 1 dpi, haben aber die Verletzungsstelle um 5 dpi gekreuzt. Wir glauben, dass dieses Protokoll eine wertvolle Technik für die Untersuchung von axonalen Nachwachsen und Neurogenese im Rückenmark nach einer Verletzung bereitzustellen. </p>

Protocol

Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität von Utah Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Vorbereitung für Chirurgie Platten Machen Chirurgie Platten mit 60 mm Petrischalen und Sylgard 184 Silikonelastomer Kit nach Herstellerangaben. Füllen Gerichte nicht mehr als halb voll und lassen Sie polymerisieren. Shop abgedeckt bei Raumtemperatur. 2. Herstellung von …

Representative Results

Um die Schwere der Gewebeschädigung die Verletzungsstelle umgebenden reduzieren, ist die richtige Abschrägung der Mikropipette kritisch. 1A zeigt eine korrekt abgeschrägte Spitze. Mit einem Tipp, der zu breit ist (Abbildung 1B) neigt dazu, in höheren Todesopfer führen durch die erhöhte Wahrscheinlichkeit von nicking die dorsale Aorta, während ein Tipp, der zu schmal ist (Abbildung 1C) neigt dazu, Blick von der Haut statt Schneiden von Gewebe. <p class="jove_c…

Discussion

Wenn zunächst das Erlernen dieser Technik, empfehlen wir versuchen nicht mehr als 50-100 Querschnitten erhalten in einer einzigen Sitzung. Nach Beherrschung dieser Technik sind wir in der Lage, bis 300 Embryonen pro Stunde durchschneiden sich; aber dieses Niveau der Durchsatz erfordert ein paar Monaten der wöchentlichen Praxis. Wir empfehlen auch, gemeinsam mit einem Reporter-Linie und Überprüfung komplette Durchtrennung bis das Auftreten von unvollständiger Durchtrennung des Rückenmarks auf weniger als 1% reduzie…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
60mm petri dish	VWR	82050-544
100mm petri dish	VWR	89038-968
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
disssection microscope	Nikon	SMZ6454
microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C
Tricaine	Acros Organics	118000100
cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1ml syringe	BD	309625
27 ga. needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20°C
micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1L)			store at RT
17.5g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10ml)			make fresh, discard extra
0.35g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1L)			store at RT
50ml 20x E2
2ml fresh 500x NaCO3