Summary
Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.
Abstract
Mamíferos falhar na recuperação sensorial e motora após lesão medular, devido à falta de rebrota axonal abaixo do nível da lesão, bem como a incapacidade de reiniciar a neurogênese espinhal. No entanto, alguns anamniotes incluindo o peixe-zebra Danio rerio exposição tanto sensorial e recuperação funcional, mesmo após transecção completa da medula espinhal. O peixe-zebra adulto é um organismo modelo estabelecido para o estudo da regeneração após lesão medular, com recuperação motora e sensorial por seis semanas após a lesão. Para aproveitar in vivo análise do processo regenerativo disponível no zebrafish larval transparente, bem como ferramentas genéticas não acessível no adulto, usamos o peixe-zebra larval para estudar a regeneração após transecção medular espinhal. Aqui demonstramos um método para reprodutível e verificável seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, nossos dados mostram recuperação sensorial início em 2 dias após a lesão (dpi), sagacidadeh o movimento C-bend detectável por 3 dpi e retomada da natação livre por 5 dpi. Assim, propõe-se o peixe-zebra larval como uma ferramenta complementar para o peixe-zebra adulto para o estudo de recuperação após a lesão medular.
Introduction
Grande trauma da medula espinal humana, muitas vezes resulta em paralisia permanente e perda de sensibilidade abaixo do nível da lesão, devido à incapacidade de crescerem axónios ou reiniciar neurogénese 1,2. Em contraste com os mamíferos, no entanto, anamniotes incluindo salamandras e peixes-zebra (Danio rerio) mostram recuperação robusta, mesmo depois de medula espinhal completa transecção 3,4.
O peixe-zebra adulto é um modelo bem estabelecido para estudar o processo de recuperação após lesão medular 5-7. Na sequência completa transecção da medula espinal, restabelecimento da função sensorial e locomotiva é observado no peixe-zebra adultos de 6 semanas após a lesão 8. A fim de examinar o processo regenerativo in vivo, nós nos voltamos para o peixe-zebra larval transparente 9.
Aqui apresentamos um método para transecto da medula espinhal de um 5 dias após a fertilização (dpf) larval usi zebrafishng de uma pipeta de microinjecção chanfrada como um bisturi, modificado a partir de Bhatt, et ai. 10 Este método oferece suporte de alto rendimento, baixa mortalidade, e reprodutibilidade. Com a prática, 300 larvas / hr pode ser seccionado, e mais de 6 meses de transecções, incluindo mais de 3.600 animais, 98,75% ± 0,72% sobreviveram até sete dias pós-lesão (dpi). Nossos dados mostram uma recuperação rápida de locomoção e sensorial, bem como: a 1 dpi, todos os movimentos pelos peixes feridos é impulsionado por peitoral apenas locomoção fin. No entanto, as larvas começam a responder ao tungstênio agulha toque caudal à transecção por 2 dpi, restabelecer o movimento C-curva por 3 dpi, e exibir natação predatória por 5 dpi 11. Usando coloração de anticorpos contra tubulina acetilada, que confirmaram que os axônios estão ausentes do local da lesão a um dpi, mas cruzaram o local da lesão por 5 dpi. Acreditamos que este protocolo irá proporcionar uma técnica valiosa para o estudo da rebrota axonal e neurogênese na medula espinhal após lesão. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando inicialmente aprender esta técnica, recomendamos tentar não mais de 50-100 transecções em uma única sessão. Depois de dominar essa técnica, somos capazes de transecto até 300 embriões por hora; no entanto, este nível de rendimento requer alguns meses de prática semanal. Recomenda-se também a prática com uma linha de repórter e verificando transsecção completa até a incidência de incompleto transecção da medula espinal é reduzida para menos de 1%.
Transecção da m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos à facilidade zebrafish Universidade de Utah para criação de animais. RID foi financiado pelo NIH R56NS053897 e LKB era um estagiário predoctoral apoiado pela iniciativa HHMI Med-Into-Grad.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
References
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