والتعديل<em> في المختبر</em> الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
يخدم مصل الدم كما جاذب كيميائي نحو الخلايا السرطانية التي تهاجر وتغزو، وتسهيل دخول الوعاء بهم إلى microvessels. ومع ذلك، تبقى جزيئات الفعلية نحو الخلايا التي تهاجر بعيد المنال. وقد تم تطوير هذا الفحص الغزو تعديلها لتحديد الأهداف التي تدفع الهجرة الخلية والغزو. هذه التقنية يقارن مؤشر الغزو تحت ثلاثة شروط لتحديد ما إذا كان هرمون معين، عامل النمو، أو خلوى يلعب دورا في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. وتشمل هذه الشروط ط) العادي مصل بقري جنيني (FBS)، والثاني)، الفحم جردت FBS (CS-FBS)، الذي يزيل الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات والثالث) CS-FBS + جزيء (الرمز "X"). وهناك تغير كبير في غزو الخلايا مع CS-FBS بالمقارنة مع FBS، يشير إلى تورط الهرمونات، والسيتوكينات أو عوامل النمو في التوسط في التغيير. ويمكن بعد ذلك أن تضاف الجزيئات الفردية إلى CS-FBS لفحص قدرتها على إعادةالآية أو إنقاذ النمط الظاهري الغزو. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من العوامل يمكن الجمع بين لتقييم المضافة أو الآثار المستمرة للجزيئات متعددة في القيادة أو تثبيط الغزو. عموما، وهذه الطريقة تمكن الباحث من تحديد ما إذا الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل / أو النمو تلعب دورا في غزو الخلايا من خلال خدمة كما chemoattractants أو مثبطات الغزو لنوع معين من الخلايا السرطانية أو متحولة محدد. من خلال تحديد chemoattractants ومثبطات محددة، قد هذا الفحص الغزو تعديل تساعد على توضيح مسارات الإشارات التي توجه غزو الخلايا السرطانية.
Introduction
وقد تم وضع الغزو فحص رواية بهدف التعرف على إشراك هرمونات معينة، السيتوكينات و / أو عوامل النمو كما chemoattractants في غزو الخلايا السرطانية. قدرة الخلايا السرطانية لغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي السمة المميزة لالنمط الظاهري النقيلي 1-3. تم غرف الغزو تستخدم على نطاق واسع كما هو الحال في المختبر أدوات لدراسة غزو الخلايا السرطانية والهجرة ويمكن أن توفر المعرفة فيما يتعلق آليات في الجسم الحي غزو الورم والانبثاث. تتكون غرف أسطواني إدراج ثقافة خلية متداخلة ضمن الآبار لوحات ثقافة الخلية. قيعان من إدراج هي البولي أو البوليسترين أغشية شبه منفذة من أحجام المسام محددة.
في غزو الفحص القياسية، هي المصنفة الخلايا على غشاء إدراج مع وسائل الإعلام الحرة المصل ووضعها في الآبار ثقافة الخلية التي تمتلئ المصل أو مثل مصل chemoattractants إلى sوآخرون تصل قوة chemoattractive. هذه الأقراص قوة خلايا للتحرك من خلال غشاء شبه منفذ (الهجرة) أو بدلا من ذلك، من خلال طلاء من المصفوفة خارج الخلية (الغزو)، ومن ثم يمكن الملون باستخدام الأصباغ التقليدية لكشف وتحديد عدد الخلايا. ثم يتم تطبيع عدد الخلايا وفقا لمدى الهجرة والغزو في خط خلية موسع. هذا الأسلوب يسمح محقق لتقييم إمكانية الغازية من أنواع مختلفة من الخلايا تحت مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك التلاعب الجيني.
الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو هي المكونات الهامة للمصل ويتزايد أظهرت أن تترافق مع القيادة النمط الظاهري الغازية 4. ومع ذلك، فإن طبيعة ودور وخصوصية هذه الجزيئات في الدم chemoattractive في التوسط الغزو لا يزال لا تزال بعيدة المنال. ويبقى التحدي لتحديد ما هي العوامل المحددة في المصل أو مثل مصل chemoattractants هي المسؤولة عن القيادةالسرطان غزو الخلايا وكذلك ما الجزيئات قد تحول دون عملية الغزو. في هذا التقرير، وصفنا منهجية لتقييم تورط محتمل من الهرمونات، والسيتوكينات و / أو عوامل النمو الموجودة في مصل الدم، والجزيئات قيادة chemoattraction وغزو الخلايا السرطانية.
في هذا البروتوكول المعدل المقترح، يتم استخدام الفحم تجريد لإزالة الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو من المصل 2٪ بقري جنيني (FBS) لتوليد FBS 2٪ الفحم تجريد (CS-FBS). وتستخدم على حد سواء 2٪ FBS و 2٪ CS-FBS وكلاء لإعداد القوة chemoattractive لدفع السرطان غزو الخلايا. باستخدام 2٪ CS-FBS كعامل chemoattractive مقارنة إلى وضعها الطبيعي 2٪ FBS يتيح العديد من المزايا بما في ذلك لأول مرة، وأبرزها، والقدرة على دراسة النمط الظاهري غزو السرطان في / الغياب النسبي انخفاض الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو. كما أنها تمكن المحقق لتقييم ما إذا كانت إزالة الجماعية من الهرمونات، وعوامل النمو، وقبرصييسبب tokines زيادة أو نقصان في مؤشر الغازية. ثم تم تصميم فحص لتحديد ما إذا كانت إضافة عنصر الفردي، وصفت بأنها "X" يمكن أن يمنع، نقصان، زيادة، أو استعادة مؤشر الغازية إلى قيمتها الأصلية (انظر الشكلين 2 و 3). على الرغم من أن هذه المنهجية هي محددة لتحقيق المستويات الفسيولوجية للعنصر الذي يتم إزالتها من المصل خلال تجريد الفحم، كما تجدر الإشارة إلى أن الفحم تجريد يمكن أن يؤثر أيضا مسارات نقل الإشارة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن الفحم تجريد يمكن أن تقلل من نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية الخلايا سليفة العظمية وتحفز تكون الشحم من خلال الحد من تفعيل MAPK 5. هي الفحم وسائل الإعلام جردت المتاحة تجاريا، وتستند على بروتوكول المبينة يجمع الفحم مع ديكستران وحضنت مع بقري جنيني المصل O / N 6.
وقد تم تطوير هذا الفحص في RESPONSE إلى نتيجة ذكرت من قبل زوكر وآخرون. 7 تظاهر المؤلفون أن النمط الظاهري متحولة تؤثر على الاتصالات الفجوة تقاطع أظهرت زيادة في مؤشر الغزو عندما يهاجرون نحو وسائل الإعلام مع العادي 2٪ FBS. تم القضاء على هذه الزيادة مع استبدال المصل جردت الفحم. من هذه النتيجة، خلص الباحثون إلى أن هذه الهجرة متحولة المتضررين نحو جزيء محبة للدهون (وبشكل أكثر تحديدا، وهو هرمون، عامل النمو، أو خلوى) 7. ومن المعروف أن الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات تتوسط مسارات إشارات تشارك في تعزيز الورم والغزو 4. وبالتالي، فمن المهم للمحققين العلمي لتحديد ما عامل (ق) هي التي تقود غزو الورم من زنزاناتهم السرطان معينة أو المسوخ قيد الدراسة. تم تصميم مقايسة لمعالجة دور المكونات الفردية في تركيزهم الفسيولوجية كما هو محدد وفقا لاختلاف بين تركيز عنصر &# 8220؛ X "في FBS العادي وCS-FBS. من خلال تطوير هذا الفحص، يمكن المحققين كسب المزيد من التبصر في مسار محدد الغازية التي تحكم النظام الخاص بهم.
وغالبا ما تصنف الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات كما المروجين الورم 8. وتستخدم بعض هذه العوامل مثل EGF كمصادر مباشرة للchemoattractants في غرف الغزو 9. وهكذا، يبدو من المرجح أن هذه تمثل المكونات الرئيسية للمصل أن غزو الورم المباشر. يقترح هذا البروتوكول بسيطة، ولكن كبير، تعديل التقليدية في المختبر فحص الغزو الذي يسمح محقق لتقييم مشاركة الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. ومع ذلك، تم تصميم مقايسة لتوفير المحقق مع جوابا حول ما إذا كان الإجراء سوف تكون فعالة لدراستهم في خطوة مبكرة في التحليل، وذلك بعدم استخدام الوقت الثمين و resources إذا رأت لزوم لها. وتستخدم هذه الطريقة CS-FBS وتعتمد على تقدير المحققين على النحو الذي الجزيئات لمتابعة كمرشحين الرصاص التي يحتمل أن توسط غزو الخلايا السرطانية. ينبغي أن نتائج هذه التحليلات يثبت أنه مفيد في تحديد التي تخدم مكونات المصل كما chemoattractants أو مثبطات للخط خلية معينة أو متحولة التي تجري دراستها. وبالإضافة إلى ذلك، قد يساعد هذا النهج المحقق تحديد مسارات الإشارات الأساسية إما تشجيع أو تثبيط غزو الخلايا السرطانية. وبالتالي توجيه تصميم الأدوية في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ورم خبيث هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا يجب أن اختراق الغشاء القاعدي، intravasate إما إلى الجهاز الليمفاوي أو الدم microvessels، والتي يتم نقلها إلى مواقع بعيدة. الخلايا السرطانية ثم يتسرب واستعمار إلى macrometastasis 12. وقد تم تعزيز التقدم من خلال الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. . The Biology of Cancer. , (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye, ., Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
