A modificação<em> In vitro</em> Invasion Ensaio para determinar o possível papel dos hormônios, citocinas e / ou fatores de crescimento na Cancer Mediating Invasion celular
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
O soro sangüíneo serve como um chemoattractant para o qual as células cancerosas migrar e invadir, facilitando a sua intravasation em microvasos. No entanto, as moléculas de reais para o qual as células migram permanecem ainda desconhecidos. Este ensaio de invasão modificado tem sido desenvolvido para identificar alvos que conduzem a migração celular e invasão. Esta técnica compara o índice de invasão sob três condições para determinar se uma hormona específica, o factor de crescimento ou citoquina desempenha um papel na mediação do potencial invasivo de uma célula de cancro. Estas condições incluem i) soro de bovino fetal normal (FBS), ii) separado com carvão activado FBS (CS-FBS), que remove as hormonas, factores de crescimento e citoquinas e iii) CS-FBS + molécula (designada por "X"). Uma alteração significativa na invasão de células com CS-FBS em comparação com FBS, indica o envolvimento de hormonas, citoquinas ou factores de crescimento na mediação da mudança. Moléculas individuais podem então ser adicionado de volta ao CS-FBS para testar a sua capacidade de reverso ou resgatar o fenótipo invasão. Além disso, dois ou mais factores podem ser combinados para avaliar o efeito aditivo ou sinérgico de múltiplas moléculas de condução ou inibir a invasão. Em geral, este método permite ao investigador para determinar se hormonas, citoquinas, e / ou os factores de crescimento desempenham um papel na invasão de células por servir como quimioatractores ou inibidores de invasão para um tipo particular de célula de cancro ou um mutante específico. Através da identificação de agentes quimioatractivos e inibidores específicos, este ensaio de invasão modificado pode ajudar a elucidar as vias de sinalização que dirigem a invasão de células de cancro.
Introduction
Um ensaio de invasão novo foi desenvolvido com o objectivo de identificar o envolvimento de hormonas específicas, citoquinas e / ou factores de crescimento como quimioatractores na invasão de células de cancro. A capacidade de células tumorais para invadir através da matriz extracelular (ECM) é uma característica marcante do fenótipo metastático 1-3. Invasão câmaras têm sido amplamente utilizados como ferramentas in vitro para estudar a invasão de células do cancro e da migração e pode proporcionar conhecimento sobre os mecanismos de invasão de tumores in vivo e metástase. As câmaras consistem em pastilhas cilíndricas de cultura de células aninhados dentro dos poços de placas de cultura de células. As partes inferiores das inserções são semi-permeáveis de poliestireno ou de policarbonato de tamanho de poro das membranas definidos.
No ensaio de invasão padrão, as células são semeadas sobre a membrana de inserção com meio isento de soro e colocadas em poços de cultura de células que são preenchidos com quimioatractores soro ou soro semelhante a set-se uma força quimioatratante. Isto dirige as células de força para mover através da membrana semi-permeável (migração) ou, em alternativa, através de um revestimento de matriz extracelular (invasão), que pode, então, ser marcadas utilizando corantes convencionais para detectar e quantificar o número de células. O número de células é então normalizados de acordo com a extensão da migração e invasão em uma linha de células não-invasiva. Este método permite que um investigador para avaliar o potencial invasivo de diferentes tipos de células sob uma variedade de condições, incluindo as manipulações genéticas.
Hormonas, citocinas e factores de crescimento são componentes críticos de soro e estão cada vez mais a ser mostrado para ser associado com a condução do fenótipo invasivo 4. No entanto, a natureza, função e especificidade destas moléculas de soro quimioatratantes na mediação invasão ainda permanecem ainda desconhecidos. O desafio continua a determinar os fatores específicos em chemoattractants soro ou soro-like são responsáveis pela conduçãoinvasão de células de cancro, bem como as moléculas que podem inibir o processo de invasão. Neste relatório, nós descrevemos uma metodologia para avaliar o potencial envolvimento de hormônios, citocinas e / ou fatores de crescimento presentes no soro, como moléculas de condução quimioatração e invasão das células cancerosas.
Neste protocolo modificado proposto, carvão remoção é utilizado para remover hormonas, citocinas e factores de crescimento a partir de 2% de soro fetal bovino (FBS) para gerar 2% de carvão despojado de FBS (CS-FBS). Ambos 2% de FBS e 2% de CS-FBS são utilizados como agentes para ajustar-se a força quimioatratante para conduzir a invasão de células do cancro. Utilizando a 2% de CS-FBS como um agente quimioatratante em comparação com o normal 2% de FBS proporciona vários benefícios, incluindo em primeiro lugar, e mais importante ainda, a possibilidade de estudar o fenótipo de invasão do cancro no reduzido / relativa ausência de hormonas, citoquinas e factores de crescimento. Ele também permite que o investigador para avaliar se a remoção coletiva de hormônios, fatores de crescimento, e cytokines provoca um aumento ou uma diminuição no índice invasivo. O ensaio é concebido para, em seguida, determinar se a adição de um componente individual, designada como "X" pode inibir, aumento, diminuição, ou restaurar o índice invasivo para o seu valor original (ver Figuras 2 e 3). Embora esta metodologia é específico para alcançar os níveis fisiológicos de o componente que é removido a partir do soro durante a remoção do carvão vegetal, deve também notar-se que o carvão de decapagem pode também afectar vias de transdução de sinal. Por exemplo, foi relatado que o carvão de decapagem pode diminuir a actividade da fosfatase alcalina de células osteoprogenitoras e induzem adipogénese por meio de redução de activadores MAPK 5. Meios de carvão despojado estão disponíveis comercialmente e são baseados no protocolo delineado que combina com carvão dextrano e incubadas com soro fetal bovino O / N 6.
Este ensaio foi desenvolvido em respoNSE a um resultado relatado por Zucker et al. 7 Os autores demonstraram que um fenótipo mutante afetando a comunicação junção gap demonstrou um aumento no índice de invasão ao migrar em direção a mídia com o normal FBS 2%. Este aumento foi eliminado, com a substituição do soro separado com carvão activado. A partir deste resultado, os autores concluíram que essa migração afetados mutante em direção a uma molécula lipofílica (mais especificamente, um hormônio, fator de crescimento, ou citocina) 7. É bem conhecido que as hormonas, factores de crescimento e citoquinas medeiam a sinalização de vias envolvidas na promoção de tumores e invasão 4. Assim, é importante para os investigadores científicos para determinar o factor de (s) a conduzir à invasão tumoral das suas células cancerosas particulares ou mutantes sob estudo. O ensaio é concebido para tratar o papel de componentes individuais na sua concentração fisiológica conforme determinado de acordo com a diferença entre a concentração do componente &# 8220; X "em SBF normal e o CS-FBS. Através do desenvolvimento deste ensaio, os investigadores podem ter mais conhecimento da via invasiva específica que regule seu sistema.
As hormonas, factores de crescimento e citocinas têm sido muitas vezes classificadas como promotores de tumor 8. Alguns destes factores tais como EGF são usados como fontes directas para quimioatractores em câmaras de invasão 9. Assim, parece provável que estes representam os principais componentes do soro que a invasão tumoral direta. Este protocolo propõe um método simples, mas significativa, a modificação do ensaio de invasão in vitro convencional, que permite que um investigador para avaliar o envolvimento das hormonas, factores de crescimento, citocinas e na mediação do potencial invasivo das células cancerosas. No entanto, o ensaio é concebido para proporcionar o investigador com uma resposta quanto ao facto de o processo será eficaz para o seu estudo em um passo inicial na análise, de modo a não usar o tempo precioso e recursos se for considerado desnecessário. Este método usa CS-FBS e baseia-se na discrição investigadores como para que as moléculas de prosseguir como chumbo candidatos que potencialmente medeiam invasão da célula cancerosa. Os resultados destas análises devem provar ser úteis na identificação de componentes do soro que servem como quimioatractores ou inibidores para a linha de células particular ou mutante a ser estudada. Além disso, esta abordagem pode ajudar a identificar o investigador principais vias de sinalização ou promover ou inibir a invasão de células de cancro; assim direcionando projeto futuro de drogas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metástase tumoral é um processo de múltiplos passos. As células devem romper a membrana basal, em intravasate ou do sistema linfático ou microvasos sanguíneos, na qual são transportadas para locais distantes. As células tumorais e, em seguida, de extravasamento em colonizar um macrometástase 12. Progressão através do epitélio para o mesenquimal (EMT), invasão tumoral e metástase tenha sido reforçada por hormônios esteróides 13,14, fatores de crescimento de 15-18, 19-21 e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
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