En modificeret<em> In vitro</em> Invasion Assay at bestemme rolle Hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer ved mediering Cancer Cell Invasion

Summary

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Abstract

Blood serum fungerer som en chemoattractant mod hvilken kræftceller migrere og invadere, lette deres intravasation i mikrokar. Men de faktiske molekyler mod hvilken cellerne migrerer forblive undvigende. Denne modificerede invasion assay er blevet udviklet til at identificere mål, der driver cellemigration og invasion. Denne teknik sammenligner invasionen indeks på tre betingelser for at afgøre, om en bestemt hormon, vækstfaktor eller cytokin spiller en rolle i formidlingen af ​​invasive potentiale en kræftcelle. Disse betingelser omfatter i) normalt bovint serum føtal (FBS), ii) kul-strippet FBS (CS-FBS), der fjerner hormoner, vækstfaktorer og cytokiner og iii) CS-FBS + molekyle (betegnet "X"). En væsentlig ændring i celle invasion med CS-FBS sammenlignet med FBS, indikerer inddragelse af hormoner, cytokiner eller vækstfaktorer i mediering ændringen. Enkelte molekyler kan derefter tilsættes tilbage til CS-FBS at analysere deres evne til at revers eller redde invasionen fænotype. Desuden kan to eller flere faktorer kombineres for at vurdere tilsætningsstoffet eller synergistiske virkninger af flere molekyler i at køre eller hæmme invasion. Samlet set denne metode gør det muligt for undersøgeren at afgøre, om hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer spiller en rolle i celle invasion ved at tjene som kemoattraktanter eller inhibitorer af invasion for en bestemt type kræft celle eller en specifik mutant. Ved at identificere specifikke kemoattraktanter og inhibitorer, kan det modificerede invasion assay være med til at belyse signalveje, der styrer kræftcelle invasion.

Introduction

En roman invasion assay er udviklet med det formål at identificere inddragelse af specifikke hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer som kemoattraktanter i kræftcelle invasion. Evnen af tumorceller til at invadere gennem den ekstracellulære matrix (ECM) er kendetegnende for den metastatiske fænotype ^1-3. Invasion kamre er blevet flittigt brugt som in vitro værktøjer til at studere kræftcellen invasion og migration og kan give viden om de mekanismer in vivo tumor invasion og metastase. Kamrene består af cylindriske cellekultur skær indlejret i brøndene i cellekulturplader. Bunden af ​​skær er semipermeable polycarbonat eller polystyren membraner af definerede porestørrelse.

I standard invasion assay podes celler på indsatsen membran med serumfrie medier og anbringes i cellekultur brønde, der er fyldt med serum eller serum-lignende kemoattraktanter til Set en chemoattractive kraft. Denne kraft drev celler at bevæge sig gennem den semipermeable membran (migration) eller alternativt via en coating af ekstracellulær matrix (invasion), som derefter kan farves under anvendelse af konventionelle farvestoffer til at detektere og kvantificere antallet af celler. Celleantallet derefter normaliseret i forhold til omfanget af migration og invasion i en noninvasiv cellelinie. Denne metode giver en investigator at evaluere den invasive potentiale af forskellige celletyper under en række betingelser, herunder genetiske manipulationer.

Hormoner, cytokiner og vækstfaktorer er kritiske komponenter i serum og i stigende grad vist sig at være forbundet med at drive den invasive fænotype ^4. Men naturen, rolle og specificitet af disse chemoattractive serum molekyler i at mediere invasion stadig undvigende. Udfordringen er fortsat at afgøre, hvilke specifikke faktorer i serum eller serum-lignende kemoattraktanter er ansvarlige for kørselcancer cell invasion samt hvad molekyler kan inhibere invasionen processen. I denne rapport beskriver vi en metode til at vurdere den potentielle inddragelse af hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer til stede i serum, som molekyler driver chemoattraktion og invasion af kræftceller.

I dette forslag modificeret protokol, er trækul stripping bruges til at fjerne hormoner, cytokiner og vækstfaktorer fra 2% føtalt bovint serum (FBS) for at generere 2% trækul strippet FBS (CS-FBS). Begge 2% FBS og 2% CS-FBS anvendes som agenter til at oprette chemoattractive kraft til at drive kræftcelle invasion. Anvendelse af 2% CS-FBS som chemoattractive middel i sammenligning med normal 2% FBS giver flere fordele, herunder første og mest fremtrædende, evnen til at studere invasion cancer fænotype i reduceret / relative mangel på hormoner, cytokiner og vækstfaktorer. Det giver også investigator at vurdere, om den kollektive fjernelse af hormoner, vækstfaktorer, og cytokines forårsager en stigning eller et fald i den invasive indeks. Assayet derefter udformet til at bestemme, om tilsætning af en enkelt komponent, der betegnes som "X" kan hæmme, falde, stige eller gendanne den invasive indeks til den oprindelige værdi (se figur 2 og 3). Selv om denne metode er specifik for at opnå de fysiologiske niveauer af den komponent, der er fjernet fra serum under trækul stripping, bør det også bemærkes, at trækul stripping også kan påvirke signaltransduktionsveje. For eksempel er det blevet rapporteret, at trækul stripning kan nedsætte alkalisk phosphatase aktivitet osteoprogenitorceller celler og inducere adipogenese ved reduktion af MAPK aktivatorer ^5. Trækulstrippet medier er kommercielt tilgængelige og er baseret på protokollen beskrevet, der kombinerer kul med dextran og inkuberet med føtalt bovint serum O / N ^6.

Dette assay blev udviklet i RespoNSE til et resultat rapporteret af Zucker et al. ⁷ Forfatterne viste, at en mutant fænotype påvirker gap junction kommunikation påvist en stigning i invasion indeks, når migrerer mod medier med normal 2% FBS. Denne stigning blev elimineret med substitution af kul-strippet serum. Fra dette resultat konkluderede forfatterne, at denne mutant påvirket migrering til et lipofilt molekyle (mere specifikt, et hormon, en vækstfaktor eller cytokin) ^7. Det er velkendt, at hormoner, vækstfaktorer og cytokiner medierer signalveje, der er involveret i tumor fremme og invasion ^4. Således er det vigtigt for videnskabelige forskere til at bestemme, hvilke (S) kører tumor invasion af deres særlige cancerceller eller mutanter under undersøgelsen. Assayet er designet til at løse den rolle af de enkelte komponenter på deres fysiologiske koncentration som bestemt i overensstemmelse med forskellen mellem koncentrationen af ​​komponenten &# 8220; X "i normal FBS og CS-FBS. Gennem udvikling af denne analyse, kan efterforskerne få mere indsigt i det specifikke invasive vej vedrørende deres system.

Hormoner, vækstfaktorer og cytokiner er ofte blevet klassificeret som tumorpromotorer ^8. Nogle af disse faktorer, såsom EGF anvendes som direkte kilder for kemoattraktanter i invasions kamre ^9. Således er det sandsynligt, at disse repræsenterer de vigtigste komponenter i serum, der direkte tumor invasion. Denne protokol foreslår en enkel, men signifikant ændring af den konventionelle in vitro invasion assay, som tillader en investigator at vurdere inddragelse af hormoner, vækstfaktorer og cytokiner i mediering af invasive potentiale af kræftceller. Imidlertid er assayet designet til at give investigator med et svar på, om proceduren vil være effektiv for deres undersøgelse på et tidligt trin i analysen, således ikke at bruge kostbar tid og rESSOURCER hvis det skønnes unødvendigt. Denne metode bruger CS-FBS og er afhængig af efterforskere skøn med hensyn til hvilke molekyler forfølge som bly kandidater, der potentielt medierer kræftcelle invasion. Resultaterne fra disse analyser skulle vise sig at være nyttige til at identificere hvilken serumkomponenter tjene som kemoattraktanter eller inhibitorer for den særlige cellelinie eller mutant blive undersøgt. Desuden kan denne fremgangsmåde hjælpe investigator identificere centrale signalveje enten fremmer eller hæmmer kræft celle invasion; således lede fremtidige drug design.

Protocol

1. Forbered forskellige medier og Yderligere komponenter Før eksperimentere forberede medier bestående af DMEM eller andre specificerede medier med tilsætning af enten normal FBS, trækul strippet FBS eller trækulstrippet FBS plus komponent, der skal testes. Bemærk, at flere komponenter kan afprøves i hvert forsøg. Afvej og fortyndes hormoner, vækstfaktorer eller cytokiner hensigtsmæssigt at blive opløst i trækul strippet serum ved fysiologisk koncentration. <p class="jove_title…

Representative Results

Invasionen indeks beregnes for hver af betingelserne under normalisering til en noninvasiv cellelinje. For vores eksperimenter, vi bruger 1205Lu melanoma cellelinien og etableret variant stabile cellelinjer som vores invasive linier samt præmaligne noninvasive variant WM793 hvorfra 1205Lu celler blev afledt 10, der tjener som en logisk styring. Vi anvender også collagen I som invasionen matrix, fordi det er den primære bestanddel af dermis. Dette er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, hvorve…

Discussion

Tumormetastase er en flertrinsproces. Cellerne skal bryde igennem basalmembranen, intravasate i enten lymfesystemet eller blod mikrokar, hvor de transporteres til fjerne steder. De tumorceller derefter ekstravasere og kolonisere i en macrometastasis ^12. Progression gennem epitelial til mesenkymale overgang (EMT), tumor invasion, og metastase er blevet styrket af steroidhormoner ^13,14, vækstfaktorer ^15-18, og cytokiner ^19-21. Disse molekyler er så kritisk at behandle signalve…

Materials

Item	Vendor	Catalog #	Comments/Description
BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates)	Corning	354578	polyethylene teraphthalate (PET) membranes
Collagen I, rat tail	Corning	354236	Source = rat tail tendon, purity = 90%
Fixative; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin
Fetal bovine Serum	Life Technologies	16000	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12676	Designated as CS-FBS
Fetal bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	Designated as CS-FBS