एक संशोधित<em> इन विट्रो</em> आक्रमण परख हार्मोन, मध्यस्थता कैंसर सेल आक्रमण में साइटोकिन्स और / या वृद्धि कारकों की संभावित भूमिका निर्धारित करने के लिए
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
रक्त सीरम कैंसर की कोशिकाओं को microvessels में अपने intravasation को सुविधाजनक बनाने, विस्थापित और आक्रमण जो की दिशा में एक chemoattractant के रूप में कार्य करता है। हालांकि, कोशिकाओं की ओर पलायन जो की दिशा में वास्तविक अणुओं मायावी रहते हैं। इस संशोधित आक्रमण परख सेल प्रवास और आक्रमण ड्राइव जो लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया है। इस तकनीक में एक विशिष्ट हार्मोन, वृद्धि कारक, या साइटोकाइन एक कैंसर सेल के आक्रामक संभावित मध्यस्थता में एक भूमिका निभाता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए तीन शर्तों के तहत आक्रमण सूचकांक तुलना करती है। इन शर्तों मैं) सामान्य भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), द्वितीय) का कोयला-छीन हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स और तृतीय) सीएस FBS के + अणु को हटा जो FBS के (सीएस-एफ बी एस), ("एक्स") चिह्नित शामिल हैं। FBS के रूप में की तुलना सीएस FBS के साथ सेल आक्रमण में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन, परिवर्तन मध्यस्थता में हार्मोन, साइटोकिन्स या वृद्धि कारकों की भागीदारी का संकेत है। व्यक्तिगत अणुओं तो फिर से करने की क्षमता परख करने के लिए सीएस FBS के लिए वापस जोड़ा जा सकता हैकविता या आक्रमण फेनोटाइप बचाव। इसके अलावा, दो या दो से अधिक कारकों additive या ड्राइविंग या आक्रमण बाधा में कई अणुओं के synergistic प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए जोड़ा जा सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि हार्मोन, साइटोकिन्स, और / या वृद्धि कारकों कैंसर सेल की एक विशेष प्रकार या एक विशिष्ट उत्परिवर्ती के लिए chemoattractants या आक्रमण के अवरोधकों के रूप में सेवारत द्वारा सेल आक्रमण में एक भूमिका निभा निर्धारित करने के लिए अन्वेषक सक्षम बनाता है। विशिष्ट chemoattractants और अवरोधकों की पहचान करके, इस संशोधित आक्रमण परख कैंसर सेल आक्रमण प्रत्यक्ष कि रास्ते संकेतन स्पष्ट करने के लिए मदद मिल सकती है।
Introduction
एक उपन्यास आक्रमण परख विशिष्ट हार्मोन, कैंसर सेल आक्रमण में chemoattractants रूप साइटोकिन्स और / या वृद्धि कारकों की भागीदारी की पहचान करने के लक्ष्य के साथ विकसित किया गया है। बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के माध्यम से आक्रमण करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता मेटास्टैटिक फेनोटाइप 1-3 की एक बानगी है। आक्रमण कक्षों बड़े पैमाने पर कैंसर सेल आक्रमण और प्रवास का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो औजार के रूप में इस्तेमाल किया गया है और इन विवो ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस के तंत्र के रूप में ज्ञान प्रदान कर सकता है। कक्षों सेल संस्कृति प्लेटों के कुओं के भीतर नेस्ट बेलनाकार सेल संस्कृति आवेषण से मिलकर बनता है। आवेषण के नीचे से परिभाषित ताकना आकार के अर्द्ध पारगम्य पॉली कार्बोनेट या polystyrene झिल्ली हैं।
मानक आक्रमण परख में, कोशिकाओं सीरम मुक्त मीडिया के साथ डालने झिल्ली पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और सीरम या सीरम की तरह chemoattractants से भर रहे हैं कि सेल संस्कृति कुओं में रखा गया है करने के लिएईटी ऊपर एक chemoattractive बल। इस बल ड्राइव कोशिकाओं तो पता लगाने और कोशिकाओं की संख्या यों के लिए पारंपरिक रंगों का उपयोग कलंकित किया जा सकता है, जो बाह्य मैट्रिक्स (आक्रमण), की एक परत के माध्यम से, वैकल्पिक रूप से अर्द्ध पारगम्य झिल्ली (माइग्रेशन) के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए या। सेल नंबर तो एक noninvasive सेल लाइन में प्रवास और आक्रमण की हद के अनुसार सामान्यीकृत है। इस विधि को एक अन्वेषक आनुवंशिक जोड़तोड़ सहित स्थितियों की एक किस्म के तहत विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की आक्रामक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है।
हार्मोन, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों सीरम के महत्वपूर्ण घटक हैं और तेजी से आक्रामक phenotype के चार ड्राइविंग के साथ जुड़े होने के लिए दिखाया जा रहा है। हालांकि, अब भी आक्रमण मध्यस्थता में इन chemoattractive सीरम अणुओं की प्रकृति, भूमिका, और विशिष्टता मायावी रहते हैं। चुनौती ड्राइविंग के लिए जिम्मेदार हैं सीरम या सीरम की तरह chemoattractants में क्या विशिष्ट कारकों का निर्धारण करने के लिए रहता हैअणुओं के आक्रमण की प्रक्रिया को बाधित कर सकता है कैंसर सेल आक्रमण के रूप में भी। इस रिपोर्ट में, हम कैंसर की कोशिकाओं की chemoattraction और आक्रमण ड्राइविंग अणुओं के रूप में, हार्मोन, साइटोकिन्स और / या सीरम में मौजूद वृद्धि कारकों के संभावित भागीदारी मूल्यांकन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन है।
इस प्रस्तावित संशोधित प्रोटोकॉल में, लकड़ी का कोयला स्ट्रिपिंग 2% लकड़ी का कोयला छीन FBS के (सीएस-एफ बी एस) उत्पन्न करने के लिए 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) से हार्मोन, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 2% FBS और 2% सीएस FBS के दोनों कैंसर सेल आक्रमण ड्राइव करने के लिए chemoattractive बल स्थापित करने के लिए एजेंट के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। सामान्य 2% FBS के की तुलना में एक chemoattractive एजेंट के रूप में 2% सीएस FBS के का प्रयोग पहली सहित कई लाभ देता है, और सबसे प्रमुखता, हार्मोन, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों के कम / रिश्तेदार अभाव में कैंसर के आक्रमण फेनोटाइप अध्ययन करने की क्षमता। यह भी हार्मोन, वृद्धि कारकों के सामूहिक हटाने का आकलन है कि अन्वेषक सक्षम बनाता है, और cytokines आक्रामक सूचकांक में वृद्धि या कमी का कारण बनता है। परख तो (आंकड़े 2 और 3 देखें) "एक्स" के रूप में नामित एक व्यक्ति घटक है, के अलावा, कमी, वृद्धि को रोकती हैं, या अपने मूल मूल्य के लिए आक्रामक सूचकांक बहाल कर सकते हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए बनाया गया है। इस पद्धति का कोयला स्ट्रिपिंग दौरान सीरम से निकाल दिया जाता है कि घटक की शारीरिक स्तर को प्राप्त करने के लिए विशिष्ट है, यद्यपि यह भी लकड़ी का कोयला स्ट्रिपिंग भी संकेत पारगमन रास्ते को प्रभावित कर सकते हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यह लकड़ी का कोयला स्ट्रिपिंग osteoprogenitor कोशिकाओं के alkaline फॉस्फेट गतिविधि कम होती है और MAPK activators 5 की कमी के माध्यम से adipogenesis पैदा कर सकते हैं कि सूचना दी गई है। चारकोल छीन मीडिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और प्रोटोकॉल पर आधारित है कि dextran के साथ लकड़ी का कोयला जोड़ती है और भ्रूण गोजातीय सीरम हे / एन 6 के साथ incubated रेखांकित कर रहे हैं।
यह परख respo में विकसित किया गया थाएनएसई जकर एट अल। 7 द्वारा रिपोर्ट एक परिणाम के लेखकों सामान्य 2% FBS के साथ मीडिया की ओर पलायन जब अंतराल जंक्शन संचार को प्रभावित करने वाले एक उत्परिवर्ती phenotype आक्रमण सूचकांक में वृद्धि का प्रदर्शन किया है कि प्रदर्शन किया। यह वृद्धि का कोयला-छीन सीरम के प्रतिस्थापन के साथ समाप्त हो गया था। इस परिणाम से, लेखकों ने निष्कर्ष निकाला है कि एक lipophilic अणु की ओर इस उत्परिवर्ती प्रभावित माइग्रेशन (अधिक विशेष रूप से, एक हार्मोन, वृद्धि कारक, या साइटोकाइन) 7। यह सर्वविदित है कि हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकाइन ट्यूमर को बढ़ावा देने और आक्रमण चार में शामिल रास्ते संकेतन कि मध्यस्थता में जाना जाता है। इस प्रकार, यह वैज्ञानिक जांचकर्ताओं क्या कारक (एस) के एक अध्ययन के तहत अपने विशेष कैंसर कोशिकाओं या म्यूटेंट के ट्यूमर आक्रमण गाड़ी चला रहे हैं यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। घटक की एकाग्रता के बीच के अंतर के हिसाब से निर्धारित परख उनके शारीरिक एकाग्रता में अलग-अलग घटकों की भूमिका का पता करने के लिए बनाया गया है और# 8220; एक्स "सामान्य FBS और सीएस FBS के में। इस परख के विकास के माध्यम से, जांचकर्ताओं को अपने सिस्टम गवर्निंग विशिष्ट आक्रामक मार्ग में और अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं।
हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स अक्सर ट्यूमर प्रमोटरों 8 के रूप में वर्गीकृत किया गया है। ऐसे EGF के रूप में इन कारकों में से कुछ आक्रमण कक्षों 9 में chemoattractants के लिए प्रत्यक्ष स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है। इस प्रकार, यह इन प्रत्यक्ष ट्यूमर आक्रमण कि सीरम के प्रमुख घटक का प्रतिनिधित्व करते हैं कि संभावना लगती है। इस प्रोटोकॉल एक अन्वेषक कैंसर की कोशिकाओं की आक्रामक संभावित मध्यस्थता में हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स की भागीदारी का आकलन करने के लिए अनुमति देता है जो परंपरागत इन विट्रो आक्रमण परख करने के लिए एक सरल, अभी तक महत्वपूर्ण, संशोधन का प्रस्ताव है। हालांकि, परख कीमती समय और अनुसंधान का उपयोग करने के रूप में नहीं, प्रक्रिया के विश्लेषण में एक प्रारंभिक कदम पर उनके अध्ययन के लिए प्रभावी हो जाएगा कि क्या करने के रूप में एक जवाब के साथ अन्वेषक प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया हैस्त्रोत अनावश्यक समझा है। इस विधि सीएस FBS के उपयोग करता है और संभावित कैंसर सेल आक्रमण कि मध्यस्थता नेतृत्व उम्मीदवार के रूप में आगे बढ़ाने के अणुओं जो के रूप में जांचकर्ताओं विवेक पर निर्भर करता है। इन विश्लेषण से परिणाम सीरम घटकों विशेष सेल लाइन या उत्परिवर्ती के लिए chemoattractants या अवरोधकों का अध्ययन किया जा रहा है के रूप में सेवा है जो की पहचान करने में उपयोगी साबित करना चाहिए। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण अन्वेषक को बढ़ावा देने या कैंसर कोशिका आक्रमण बाधा या तो कुंजी संकेत दे रास्ते की पहचान में मदद कर सकते हैं; इस प्रकार भविष्य दवा डिजाइन निर्देशन।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर मेटास्टेसिस एक multistep प्रक्रिया है। कोशिकाओं, तहखाने झिल्ली के माध्यम से तोड़ने वे दूर के स्थानों पर ले जाया जाता है, जिसमें लसीका प्रणाली या रक्त या तो microvessels, में intravasate चाहिए। ट्यूमर कोशिकाओं को फिर …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. . The Biology of Cancer. , (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye, ., Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
