En Modifisert<em> In vitro</em> Invasion analyse for å bestemme den potensielle rolle hormoner, Cytokiner og / eller vekstfaktorer i formidling Cancer Cell Invasion

Summary

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Abstract

Blod serum fungerer som en kjemoattraktant mot som kreftceller migrere og invadere, tilrettelegging deres intravasation inn microvessels. Men selve molekylene mot hvilken cellene migrerer forblir unnvikende. Denne modifiserte invasjon analysen har blitt utviklet for å identifisere mål som driver cellemigrering og invasjon. Denne teknikk sammen invasjonen indeks under tre betingelser for å bestemme om et bestemt hormon, vekstfaktor, eller cytokin spiller en rolle i mediering av den invasive potensialet i en kreftcelle. Disse tilstandene omfatter i) normalt føtalt bovint serum (FBS), ii) trekull-strippet FBS (CS-FBS), som fjerner hormoner, vekstfaktorer og cytokiner og iii) CS-FBS + molekyl (betegnet "X"). En vesentlig endring i celle invasjon med CS-FBS i forhold til FBS, indikerer involveringen av hormoner, cytokiner eller vekstfaktorer for å mediere endring. Individuelle molekyler kan deretter tilsettes tilbake til CS-FBS for å bestemme deres evne til å gjenvers eller redde invasjonen fenotype. Videre kan to eller flere faktorer kombineres for å evaluere den additive eller synergistiske effekt av multiple molekyler i kjøring eller inhibering av invasjon. Totalt, muliggjør denne fremgangsmåte undersøkeren å bestemme hvorvidt hormoner, cytokiner og / eller vekstfaktorer spiller en rolle i celle invasjon ved å tjene som kjemoattraktanter eller hemmere av invasjon for en bestemt type kreftcelle eller en spesifikk mutant. Ved å identifisere spesifikke chemoattractants og hemmere, kan dette endres invasjonen analysen bidra til å belyse signalveier som styrer kreftcelle invasjon.

Introduction

En roman invasjon analysen er utviklet med mål om å identifisere involvering av bestemte hormoner, cytokiner og / eller vekstfaktorer som chemoattractants i kreftcelle invasjon. Muligheten av kreftceller til å invadere gjennom ekstracellulære matrise (ECM) er et kjennetegn på den metastatisk fenotype ^1-3. Invasjons kamre har blitt mye brukt som in vitro verktøy for å studere kreftcelle invasjon og migrasjon og kan gi kunnskap om mekanismene for in vivo tumorinvasjon og metastasering. Kamrene består av sylindriske celledyrkningsinnsatser nestet i brønnene i cellekulturskåler. Bunnene av innsatsene er semi-permeable polykarbonat eller polystyren membraner av definerte porestørrelser.

I standard invasjon analysen, blir cellene sådd ut på innsatsen membran med serumfritt medium og plasseres i cellekulturbrønner som er fylt med serum eller serumlignende chemoattractants å set opp en chemoattractive kraft. Denne kraft stasjoner celler til å bevege seg gjennom den semi-permeabel membran (migrasjon) eller alternativt, gjennom et lag av ekstracellulær matriks (invasjon), som så kan farges ved hjelp av konvensjonelle fargestoffer for å påvise og kvantifisere antallet celler. Celletallet blir deretter normalisert i henhold til den grad av migrering og invasjon i en ikke-invasiv cellelinje. Denne metoden tillater en undersøker for å evaluere potensialet for invasiv forskjellige celletyper under en rekke forhold, inkludert genetiske manipulasjoner.

Hormoner, cytokiner og vekstfaktorer er kritiske komponenter i serum, og er i økende grad blitt vist å være forbundet med driv invasive fenotype ^4. Imidlertid er naturen, rolle, og spesifisiteten av disse chemoattractive serum molekyler i å mediere invasjon fortsatt unnvikende. Utfordringen er fortsatt å finne ut hvilke konkrete faktorer i serum eller serum-lignende chemoattractants er ansvarlig for kjøringkreftcelle invasjon, så vel som hvilke molekyler kan hemme invasjon prosessen. I denne rapporten beskriver vi en metode for å evaluere den potensielle engasjement av hormoner, cytokiner og / eller vekstfaktorer som er tilstede i serum, som molekyler som driver chemoattraction og invasjon av kreftceller.

I denne foreslåtte modifisert protokoll, blir kull stripping anvendes for å fjerne hormoner, cytokiner og vekstfaktorer fra 2% føtalt bovint serum (FBS) for å generere 2% trekull strippet FBS (CS-FBS). Begge 2% FBS og 2% CS-FBS brukes som midler for å sette opp chemoattractive kraft for å drive kreftcelleinvasjon. Ved bruk av 2% CS-FBS som chemoattractive middel i forhold til det normale 2% FBS gir flere fordeler, inkludert første og mest fremtredende, evnen til å studere kreftinvasjon fenotype i den reduserte / relative fravær av hormoner, cytokiner og vekstfaktorer. Det gjør det også mulig etterforsker for å vurdere om den kollektive fjerning av hormoner, vekstfaktorer, og cytokines fører til en økning eller reduksjon i invasiv indeksen. Analysen ble deretter utviklet for å bestemme om tilsetningen av en enkelt komponent, betegnet som "X" kan hemme, økning, reduksjon eller gjenopprette invasiv indeksen til den opprinnelige verdien (se figurene 2 og 3). Selv om denne metoden er spesifikk for å oppnå de fysiologiske nivåer av den komponent som blir fjernet fra serum under kull stripping, bør det også bemerkes at kull stripping kan også påvirke signaltransduksjonsveier. For eksempel har det blitt rapportert at kull stripping kan redusere den alkaliske fosfatase aktiviteten av osteoprogenitor celler og indusere adipogenese gjennom reduksjon av MAPK-aktivatorer ^5. Trekull strippet media er kommersielt tilgjengelige og er basert på protokollen beskrevet som kombinerer kull med dekstran og inkubert med føtalt bovint serum O / N ^6.

Dette assay ble utviklet i respoNSE å følge rapportert av Zucker et al. ⁷ Forfatterne demonstrerte at en mutant fenotype påvirker gap junction-kommunikasjon, viste en økning i invasjonen indeksen ved migrering mot medier med normal 2% FBS. Denne økningen ble eliminert med substitusjon av trekull-strippet serum. Fra dette resultatet, forfatterne konkluderte med at dette mutant påvirket migrasjon mot et lipofilt molekyl (mer spesifikt, et hormon, vekstfaktor, eller cytokin) ^7. Det er velkjent at hormoner, vekstfaktorer og cytokiner megle signalveier involvert i svulstutvikling, og invasjon ^4. Således er det viktig for vitenskapelige søkere for å bestemme hvilke faktoren (e) som driver tumorinvasjon av deres spesielle kreftceller eller mutanter under studien. Analysen er utformet for å ta opp den rollen de enkelte komponenter ved deres fysiologiske konsentrasjon som bestemt i henhold til differansen mellom konsentrasjonen av komponenten &# 8220; X "i normal FBS og CS-FBS. Gjennom utviklingen av denne analysen, kan etterforskerne få mer innsikt i den spesifikke invasiv pathway regulerer deres system.

Hormoner, vekstfaktorer og cytokiner har ofte blitt klassifisert som tumorpromotere ^8. Noen av disse faktorer som EGF blir brukt som direkte kilder for chemoattractants i invasjonskamre ^9. Således er det sannsynlig at disse representerer de viktigste komponentene i serum som direkte tumorinvasjon. Denne protokollen foreslått en enkel, men signifikant, modifikasjoner til de konvensjonelle in vitro-analyse som tillater invasjon en undersøker for å vurdere involvering av hormoner, vekstfaktorer og cytokiner i mediering av den invasive potensialet av kreftceller. Imidlertid er analysen er utformet for å tilveiebringe undersøkeren med et svar på om fremgangsmåten vil være effektive for deres studie på et tidlig trinn i analysen, slik at det ikke å bruke dyrebar tid og resources hvis det anses unødvendig. Denne metoden bruker CS-FBS og er avhengig av etterforskere skjønn med hensyn til hvilke molekyler å forfølge som bly kandidater som potensielt megle kreft celle invasjon. Resultatene fra disse analyser bør vise seg å være nyttig for å identifisere hvilke serumkomponenter tjener som kjemotiltrekkende midler eller inhibitorer for den spesielle cellelinjen eller mutant som studeres. I tillegg kan denne tilnærmingen hjelpe etterforsker identifisere viktige signalveier enten fremmer eller hemmer kreftcelle invasjon; dermed regissere fremtiden drug design.

Protocol

1. Forbered Ulike medier og tilleggskomponenter Før eksperimentere, forberede medier bestående av DMEM, eller andre angitte medier med tilsetning av enten normal FBS, trekull strippet FBS, eller trekull strippet FBS, pluss den komponent som skal testes. Legg merke til at flere komponenter kan bli testet i hvert forsøk. Vei ut og fortynne hormoner, vekstfaktorer eller cytokiner hensiktsmessig å bli oppløst i trekull strippet serum i fysiologisk konsentrasjon. 2. …

Representative Results

Invasjonen Indeksen blir beregnet for hver tilstand i henhold til normalisering til en ikke-invasiv cellelinje. For våre eksperimenter, bruker vi 1205Lu melanom-cellelinje, og etablerte variant stabile cellelinjer som våre invasive linjer samt premaligne noninvasive variant, WM793 hvorfra 1205Lu celler ble avledet 10 som tjener som en logisk kontroll. Vi kan også anvende kollagen I som invasjonen matrise, fordi det er den primære komponent i dermis. Dette er i samsvar med en tidligere undersøkelse, hvorv…

Discussion

Tumormetastase er en flertrinns prosess. Cellene må bryte gjennom basalmembran, intravasate inn enten lymfatiske eller blod microvessels, der de blir transportert til fjerne steder. Tumorceller deretter ekstravasere og kolon inn en macrometastasis ^12. Progresjon gjennom epitelial til mesenchymale overgang (EMT), tumor invasjon og metastasering har blitt forsterket av steroidhormoner ^13,14, faktorer vekst ^15-18, og cytokiner ^19-21. Disse molekylene er så avgjørende for å ta…

Materials

Item	Vendor	Catalog #	Comments/Description
BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates)	Corning	354578	polyethylene teraphthalate (PET) membranes
Collagen I, rat tail	Corning	354236	Source = rat tail tendon, purity = 90%
Fixative; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin
Fetal bovine Serum	Life Technologies	16000	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12676	Designated as CS-FBS
Fetal bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	Designated as CS-FBS