Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren
Summary
Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.
Abstract
Lipid-Doppelschichtmembranen zu bilden, die Plasmamembranen der Zellen und definieren die Grenzen der subzellulären Organellen. In der Natur werden diese Membranen sind heterogene Gemische von vielen Arten von Lipiden, enthalten membrangebundene Proteine und sind dekoriert mit Kohlenhydraten. In einigen Experimenten, ist es wünschenswert, die biophysikalischen oder biochemischen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht von denjenigen der natürlichen Membran entkoppeln. Solche Fälle erfordern die Verwendung von Modellsystemen, wie Riesen-Vesikel, Liposomen oder unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs). Arrays von SLBs sind für Sensoranwendungen und imitiert die Zell-Zell-Interaktionen besonders attraktiv. Hier beschreiben wir ein neues Verfahren zur Bildung SLB-Arrays. Submicron-Durchmesser SiO 2-Kugeln werden zunächst mit Lipid-Doppelschichten beschichtet, um sphärische SLBs (SSLBs) zu bilden. Die Kügelchen werden dann in einer Anordnung von Mikro hergestellt Submikron-Durchmesser Vertiefungen abgeschieden. Die Herstellung Technik verwendet eine "Rakel", um die Substratoberfläche zu reinigen, während leaving hinter SSLBs, die in Mikrovertiefungen niedergelassen haben. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Modifikation des Mikrovertiefungs Substrat, noch eine besondere Zielliganden auf der SSLB. Mikrowells durch einzelne Perlen besetzt, weil der Durchmesser gut abgestimmt ist, nur größer als der Kugeldurchmesser sein. Typischerweise mehr 75% der Brunnen belegt sind, während der Rest leer bleiben. In Puffer SSLB Arrays anzuzeigen langfristige Stabilität von mehr als einer Woche. Mehrere Arten von SSLBs können in einem Array von seriellen Abscheidung gebracht werden, und die Anordnungen können zum Abtasten verwendet werden, was wir demonstrieren durch Charakterisierung der Wechselwirkung von Choleratoxin mit Gangliosid GM1. Wir zeigen auch, dass die Phospholipid-Vesikel ohne den Wulst Stützen und Biomembranen aus zellulären Quellen kann mit dem gleichen Verfahren angeordnet werden und Zell-spezifischen Membran-Lipide identifiziert werden.
Introduction
Lipid-Doppelschicht-Membranen sind wesentliche Strukturen in der Natur. Zellplasmamembranen und Organellen-Membranen sind aus Lipid-Doppelschichten, die eine Reihe von Molekülen, die für das Leben notwendig sind, zusammengesetzt zu integrieren. Viele lebenserhaltenden Prozesse auf der Oberfläche von Zellen vorkommen oder durch Moleküle mit Lipid-Doppelschichtmembranen assoziiert vermittelt. In der Tat sind viele Arzneimittel Ziel Prozesse oder Moleküle auf oder in Membranen 1,2 gefunden. Es ist daher notwendig, analytisch untersuchen Prozesse wie chemische Reaktionen oder nichtkovalente Bindungsereignisse, die auf Membranoberflächen auftreten. Da die natürlichen Membranen kann schwierig sein, mit Sensoren zu isolieren und / oder eine Schnittstelle sein, viele Forscher beschäftigen vereinfachte Modellmembranen zur Durchführung von analytischen Studien. Eine Anzahl von Modellmembransysteme sind in der Literatur beschrieben, von Riesenvesikeln, die zehn bis hundert Mikrometer im Durchmesser, um Liposomen mit nanoskaligen Abmessungen 3,4 sein kann. Alternverhältnismäßig planaren Lipid-Doppelschichten auf festen Trägern abgeschieden, dh unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs), können auf einer Reihe von verschiedenen Oberflächen hergestellt werden und wurden vielfach in der biophysikalischen, biochemischen und analytischen Anwendungen 5 verwendet. Koppeln SLBs mit elektrischen oder optischen Materialien ermöglicht Untersuchung von Membran Biochemie und Biophysik durch die Verwendung von verschiedenen analytischen Techniken. Fluoreszenzmikroskopie 6, 7 der Elektrochemie, optische Spektroskopie 8, 9 der Rastersondenmikroskopie, Oberflächen-Plasmon-Resonanz 10 und Massenspektrometrie 11 wurden alle verwendet, um die Struktur und Eigenschaften von SLBs zu studieren.
SLB-Arrays bieten zusätzliche Flexibilität bei der Gestaltung von Sensoren für die Multiplex-Assays 12,13. Andere Anwendungen verwenden SLB-Arrays, um die Verbindung, die zwischen Immunzellen 14 bildet imitieren. Aufbereitungsmethoden für SLB-Arrays wurden aus microFlu variiertidic nähert sich 15 bis diejenigen, die physikalischen Barrieren zwischen benachbarten SLB-Patches zu verwenden. Andere Gruppen haben 16 Druckverfahren verwendet, 17, 18 und photochemischen Strukturierung verschiedener Nanotechnik nähert sich 19 bis SLB-Arrays erstellen.
In diesem Papier und begleitende Video zeigen wir ein Verfahren zur Bildung SLB-Arrays durch Aufbringen von SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln in geordnete Reihen von Vertiefungen 20. Wir verweisen auf die SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln als Kugel unterstützt Lipid-Doppelschichten (SSLBs). Diese Technik ist eine Erweiterung der früheren Arbeit, die Arrays von Phospholipid-Vesikeln und Biomembranen aus natürlichen Quellen, 21, aus dem wir zeigen auch, beispielsweise Ergebnisse abgeleitet erstellt. Andere Methoden zum Ordnen Biomembran Partikel oder Vesikel auf Mustern der spezifischen Targeting-Liganden auf Oberflächen, die mit komplementären Liganden auf der Vesikel-Oberfläche enthalten assoziieren verlassen. Beispiele sind Biotin-Avidin Verein 22,23 und DNA-Hybridisierungssysteme 24. Unser Ansatz erfordert nur eine Mikrowell-Array ohne Targeting oder Erkennungsgruppen erforderlich. Die Größe SSLBs wird durch den Durchmesser der SiO 2-Trägern Wulst, die eine geringe Polydispersität aufweisen definiert. Durch die Abstimmung der Mikrowell-Durchmesser, nur größer als der Durchmesser SSLB, setzt sich nur eine einzige SSLB in jede Vertiefung. Ein Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Rakel entfernt dann von der Oberfläche SSLBs alle, die nicht in Mikro immobilisiert sind. Die Streifen und die daraus resultierende SSLB Arrays hoher Dichte (~ 10 5 SSLBs / mm 2) mit 3 um Mitte-zu-Mitte-Abstand und Sechskant Periodizität. Abscheiden von seriell SSLBs mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen ist es möglich, Mehrkomponenten-Arrays mit zufällig positionierten SSLBs erstellen. Um die Erfassungsfähigkeit SSLB Arrays zeigen, haben wir die Wechselwirkung von Choleratoxin (CTX) mit einem Gangliosid (GM1) in die SSLBs aufgenommen. Mitnatürlichen Membranpartikel, waren wir in der Lage, zellspezifische Lipide im Mehrkomponenten-Arrays enthalten Membranmaterial aus zwei unterschiedlichen Zelltypen zu detektieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wird gezeigt, dass monodisperse SiO 2-Kugeln mit unterstützten Lipiddoppelschichten überzogen werden können, ohne die Notwendigkeit von Zielliganden auf den Lipid-Doppelschichten und der Substratoberfläche in Mikrotiterplatten Arrays angeordnet werden, und die Anordnungen können zur Charakterisierung von Toxin-Lipid-Wechselwirkungen verwendet werden. Die Dissoziationskonstante wir CTx/GM1 Bindung berechnet vergleicht vorteilhaft, da die großen Unterschiede der Werte in der Literatur, mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an SHO von den National Institutes of Health (R01 GM092993) unterstützt, der National Science Foundation (NSF Career Award und DBI 0964216), dem Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Programm und die Minnesota Partnership Award für Biotechnologie und Medical Genomics. Geräte-Fertigung wurde an der Universität von Minnesota und Nanofabrikation Center (NFC), die Unterstützung von der NSF durch die National Nanotechnology Infrastructure Netzwerk empfängt. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse zu MR von den National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), der National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), der Applebaum, Hilton, Peterson und Sanford Stiftungen und der Familie McNeilus unterstützt. Die Autoren möchten Hyungsoon Im für die Unterstützung bei Abbildungen und Shailabh Kumar für die Unterstützung bei der Rasterelektronenmikroskopie danken.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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