Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette
Summary
Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.
Abstract
Membranes bicouches lipidiques forment les membranes plasmiques des cellules, et définissent les limites des organites subcellulaires. Dans la nature, ces membranes sont des mélanges hétérogènes de nombreux types de lipides, contiennent des protéines membranaires et sont décorées avec des hydrates de carbone. Dans certaines expériences, il est souhaitable de découpler les propriétés biophysiques et biochimiques de la bicouche lipidique de celles de la membrane naturelle. Ces cas nécessitent l'utilisation de systèmes modèles tels que vésicules géantes, des liposomes ou des bicouches lipidiques supportées (BLP). Les tableaux de BLP sont particulièrement attrayants pour les applications de détection et imitant les interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour former des tableaux SLB. Submicronique diamètre SiO 2 perles sont d'abord revêtus de bicouches lipidiques pour former BLP sphériques (SSLBs). Les billes sont ensuite déposés dans une matrice de micro-puits de micro-fabriqué sous-micron de diamètre. La technique de préparation utilise un "raclette" pour nettoyer la surface du substrat, tandis que leaving derrière SSLBs qui se sont installés dans des micropuits. Ce procédé ne nécessite aucune modification chimique du substrat de micropuits, ni aucun des ligands de ciblage particulier sur la SSLB. Les micropuits sont occupés par des billes uniques parce que le diamètre du puits est réglée pour être juste supérieur au diamètre du bourrelet. En règle générale, plus de 75% des puits sont occupés, tandis que le reste demeure vide. Dans tampon tableaux SSLB affichent une stabilité à long terme de plus d'une semaine. Plusieurs types de SSLBs peuvent être placés dans un tableau unique par dépôt en série, et les matrices peuvent être utilisées pour la détection, dont on démontre par la caractérisation de l'interaction de la toxine cholérique avec le ganglioside GM1. Nous montrons également que les vésicules de phospholipides sans supports de talon et des membranes biologiques à partir de sources cellulaires peuvent être disposés avec la même méthode et les lipides membranaires spécifiques de cellules peuvent être identifiées.
Introduction
Membranes bicouches lipidiques sont des structures essentielles dans la nature. Les membranes plasmiques et les membranes cellulaires des organites sont composées de bicouches lipidiques incorporant un certain nombre de molécules qui sont nécessaires à la vie. De nombreux procédés de survie se produisent sur la surface de cellules ou sont médiées par des molécules associées aux membranes bicouches de lipides. En fait, de nombreux procédés pharmaceutiques ou des molécules cibles se trouvent sur ou dans les membranes 1,2. Il est donc nécessaire d'étudier analytiquement les processus, tels que des réactions chimiques ou des événements de liaison non covalentes qui se produisent sur les surfaces de la membrane. Les membranes naturelles peuvent être difficiles à isoler et / ou l'interface de capteurs, de nombreux chercheurs utilisent des membranes modèles simplifiés de réaliser des études analytiques. Un certain nombre de systèmes de membrane modèle sont décrits dans la littérature, allant de vésicules géantes qui peuvent être des dizaines à des centaines de microns de diamètre à des liposomes de dimensions nanométriques 3,4. Alterntivement, des bicouches lipidiques planes déposés sur des supports solides, à savoir, soutenus bicouches lipidiques (BLP), peuvent être formées sur un certain nombre de surfaces différentes et ont été largement utilisés dans des applications biophysiques, biochimiques et d'analyse 5. Couplage BLP avec des matériaux électriques ou optiques permet l'étude de la biochimie et de la biophysique de la membrane grâce à l'utilisation de différentes techniques d'analyse. Microscopie de fluorescence 6, 7 électrochimie, la spectroscopie optique 8, la microscopie à sonde de balayage 9, la résonance plasmonique de surface 10, et la spectrométrie de masse 11 ont tous été utilisés pour étudier la structure et les propriétés de BLP.
Tableaux SLB offrent plus de polyvalence dans la conception de capteurs pour les essais multiplex 12,13. D'autres applications utilisent des tableaux SLB pour imiter la jonction qui se forme entre les cellules immunitaires 14. Méthodes de préparation pour les tableaux SLB ont varié de microfluidic atteint près de 15 pour ceux qui emploient des barrières physiques entre les parcelles adjacentes SLB. 16 autres groupes ont utilisé des méthodes d'impression 17, 18 et structuration photochimique diverses approches nanogénie 19 pour créer des tableaux SLB.
Dans le présent document vidéo d'accompagnement et nous démontrons une méthode pour former des réseaux par dépôt SLB SLB-SiO 2 revêtues perles en ensembles ordonnés de micropuits 20. Nous nous référons aux SLB-revêtus de SiO 2 perles en bicouches sphériques soutenues lipidiques (SSLBs). Cette technique est une extension des travaux antérieurs qui a créé des tableaux de vésicules de phospholipides et les membranes biologiques dérivés de sources naturelles 21, à partir de laquelle nous montrons aussi par exemple des résultats. D'autres procédés pour rangeant particules de biomembrane ou vésicules se sont appuyés sur les modes de ligands de ciblage spécifiques sur des surfaces qui s'associent avec des ligands complémentaires contenues sur la surface des vésicules. Les exemples incluent la biotineassociation avidine 22,23 et systèmes d'hybridation d'ADN 24. Notre approche ne nécessite qu'un réseau de micro-puits sans ciblage ou de reconnaissance des groupements nécessaires. La taille de SSLBs est défini par le diamètre des supports de SiO 2 de perles, qui ont une faible poly-dispersité. En ajustant le diamètre de microtitration à un peu plus grand que le diamètre SSLB, un seul SSLB se dépose dans chaque micropuits. Un poly (diméthyl siloxane) (PDMS) racloir enlève ensuite la surface de tous les SSLBs qui ne sont pas immobilisés dans des micropuits. Les puits et les tableaux SSLB résultantes ont haute densité (~ 10 5 SSLBs / mm 2) avec 3 pm espacement centre à centre et la périodicité hexagonale. En déposant en série avec SSLBs compositions lipidiques différentes, il est possible de créer des tableaux à plusieurs composants avec SSLBs positionnées de manière aléatoire. Afin de démontrer la capacité de détection de réseaux SSLB, nous avons utilisé l'interaction de la toxine cholérique (CTx) avec un ganglioside (GM1) incorporés dans les SSLBs. Avecparticules membranaires naturelles, nous avons pu détecter des lipides spécifiques des cellules dans des tableaux à plusieurs composants contenant des matières de la membrane à partir de deux types de cellules différents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, nous montrons que monodisperses SiO 2 perles enrobées avec les bicouches lipidiques en charge peuvent être disposés en rangées de puits de microtitration, sans la nécessité de ligands de ciblage sur les bicouches lipidiques ou la surface du substrat, et les matrices peuvent être utilisées pour la caractérisation des interactions de toxine-lipide. Le nous constante de dissociation calculée pour la liaison CTx/GM1 compare favorablement, compte tenu de la grande disparité des valeurs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions à SHO des National Institutes of Health (R01 GM092993), la National Science Foundation (NSF Career Award et DBI 0.964.216), l'Office of Naval Research (ONR) Programme du jeune chercheur et le Prix du partenariat Minnesota pour la biotechnologie et génomique médicale. fabrication de l'appareil a été réalisée à l'Université du Minnesota nanofabrication Center (NFC), qui reçoit le soutien de la NSF à travers le Réseau National Nanotechnology Infrastructure. Ce travail a également été soutenue par des subventions à M. de la National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), la National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), la Applebaum, Hilton, Peterson et Sanford fondations et la famille McNeilus. Les auteurs tiennent à remercier Hyungsoon Im à l'aide d'illustrations et de Shailabh Kumar d'assistance à la microscopie électronique à balayage.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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