Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode
Summary
Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.
Abstract
Lipide dubbellaag membranen de plasmamembranen van cellen en definiëren de grenzen van subcellulaire organellen. In de natuur, deze membranen zijn heterogene mengsels van vele soorten lipiden, membraan-gebonden eiwitten bevatten en zijn versierd met koolhydraten. In sommige experimenten, is het wenselijk om de biofysische en biochemische eigenschappen van de lipide bilaag van die van de natuurlijke membraan ontkoppelen. Dergelijke gevallen oproep voor het gebruik van modelsystemen zoals reus vesicles, liposomen of ondersteunde lipide bilagen (SLBs). Arrays van SLBs zijn bijzonder aantrekkelijk voor toepassing bij het aftasten nabootsen cel-cel interacties. Hier beschrijven we een nieuwe werkwijze voor het vormen SLB arrays. Submicron diameter SiO2 kralen worden eerst bekleed met lipide bilagen bolvormig SLBs (SSLBs) vormen. De kralen worden vervolgens gestort op een scala aan micro-gefabriceerde submicron-diameter microwells. De bereiding techniek maakt gebruik van een "trekker" naar het substraatoppervlak te reinigen, terwijl leaving achter SSLBs die zich hebben gevestigd in microwells. Deze methode vereist geen chemische modificatie van de microwell substraat, noch het bijzonder gericht op liganden op SSLB. Microwells worden bezet door enkele parels omdat de goed diameter is afgestemd op net groter is dan de kraal diameter. Typisch, meer 75% van de putten bezet, terwijl de rest leeg blijven. In buffer SSLB arrays weer stabiliteit op lange termijn van meer dan een week. Meerdere soorten SSLBs kan in een array geplaatst door seriële afzetting en de arrays kunnen worden gebruikt voor detectie, waarvan we aantonen Door die interactie van choleratoxine met ganglioside GM1. We tonen ook dat fosfolipide vesicula zonder kraal ondersteunt en biomembranen uit cellulaire bronnen kunnen bekleed worden met dezelfde methode en celspecifieke membraanlipiden kunnen worden geïdentificeerd.
Introduction
Lipide dubbellaag membranen essentieel die in de natuur. Cellulaire plasmamembranen en organel membranen bestaan uit lipide bilagen die een aantal moleculen die nodig zijn voor het leven nemen. Veel levensverlengende processen plaatsvinden op het oppervlak van cellen of worden gemedieerd door moleculen geassocieerd met lipide bilaag membranen. In feite zijn veel geneesmiddelen doelprocessen of moleculen aangetroffen op of in membranen 1,2. Het is daarom noodzakelijk om analytisch processen, zoals chemische reacties of niet-covalente binding gebeurtenissen die zich voordoen op membraanoppervlakken onderzoeken. Omdat natuurlijke membranen moeilijk te isoleren en / of interface met sensoren kan zijn, veel onderzoekers in dienst vereenvoudigd model membranen analytische studies uit te voeren. Een aantal model membraansystemen worden beschreven in de literatuur, van grote blaasjes die kunnen tientallen tot honderden micron in diameter liposomen de nanodeeltjes 3,4. Alternlatief, vlakke lipide bilagen afgezet op vaste dragers, bijvoorbeeld, ondersteund lipide bilagen (SLBs), kan worden gevormd op een aantal verschillende oppervlakken en zijn op grote schaal gebruikt in de biofysische, biochemische en analytische toepassingen 5. Koppeling SLBs elektrische of optische materialen stelt onderzoek membraan biochemie en biofysica door het gebruik van verschillende analytische technieken. Fluorescentie microscopie 6, elektrochemie 7, 8 optische spectroscopie, scanning probe microscopie 9, oppervlakte plasmon resonantie 10 en massaspectrometrie 11 zijn allemaal gebruikt om de structuur en eigenschappen van SLBs bestuderen.
SLB arrays bieden extra flexibiliteit bij het ontwerpen van sensoren voor multiplex assays 12,13. Andere toepassingen gebruiken SLB arrays om de kruising die zich vormt tussen immuuncellen 14 na te bootsen. Bereidingswijzen voor SLB arrays hebben varieerde van microfluIDIC benaderingen 15 aan degenen die fysieke barrières tussen aangrenzende SLB plekken in dienst. 16 Andere groepen hebben gebruikt drukmethodes 17, fotochemische patronen 18 en diverse nanoengineering benaderingen 19 tot SLB arrays te maken.
In dit artikel en de bijbehorende video tonen we een methode voor het vormen van SLB arrays door het storten van SLB-gecoate SiO 2 kralen in besteld arrays van microwells 20. We verwijzen naar de SLB-gecoate SiO 2 kralen als sferische ondersteund lipidendubbellagen (SSLBs). Deze techniek is een uitbreiding van eerdere werk dat arrays van fosfolipideblaasjes en biomembranen afkomstig van natuurlijke bronnen 21, waaruit we tonen ook bijvoorbeeld resultaten gemaakt. Andere werkwijzen voor arraying biomembraan deeltjes of blaasjes hebben zich op patronen van specifieke targeting liganden op oppervlakken die associëren met aanvullende liganden die op het blaasje oppervlak. Voorbeelden omvatten biotine-avidine vereniging 22,23 en DNA hybridisatie regelingen 24. Onze aanpak vereist slechts een microwell reeks zonder targeting of erkenning groepen nodig. De grootte van SSLBs wordt bepaald door de diameter van de SiO2 kraal dragers, die lage poly-dispersiteit heeft. Door het afstemmen van de microputjes diameter net groter is dan de diameter SSLB slechts een SSLB regelt in elk microputje. Een poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) zuigmond verwijdert vervolgens van het oppervlak alle SSLBs die niet worden geïmmobiliseerd in microwells. De microputjes en de resulterende SSLB arrays met hoge dichtheid (~ 10 5 SSLBs / mm 2) met 3 urn hart-op-hart afstand en zeshoekige periodiciteit. Door serieel afzetten SSLBs verschillende lipidesamenstellingen, is het mogelijk om multicomponent arrays met willekeurig geplaatste SSLBs maken. Om het registrerende vermogen van SSLB arrays tonen gebruikten we de interactie van choleratoxine (CTx) met ganglioside (GM1) opgenomen in de SSLBs. Metnatuurlijke membraan deeltjes konden we celspecifieke lipiden detecteren multicomponent arrays met membraanmateriaal twee verschillende celtypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk wordt aangetoond dat monodisperse SiO2 kralen bekleed met ondersteunde lipide bilagen kan worden bekleed in microwell arrays zonder dat targeting liganden op lipide dubbellagen of het substraatoppervlak, en de arrays kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van toxine-lipide interacties. De dissociatieconstante we berekend CTx/GM1 binding steekt gunstig, gezien de grote verschillen van waarden in de literatuur, een eerder rapport van Winter et al.. Waar colloïdale samenvoegen van l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan SHO van de National Institutes of Health (R01 GM092993), de National Science Foundation (NSF LOOPBAAN Award en DBI 0.964.216), de Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program en de Minnesota Partnership Award voor Biotechnologie en Medical Genomics. Apparaat fabricage werd uitgevoerd bij de Nanofabrication Centrum Universiteit van Minnesota (NFC), dat wordt ondersteund door de NSF door de National Nanotechnology Infrastructure Network. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan MR van de National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), de National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), de Applebaum, Hilton, Peterson en Sanford Stichtingen en de familie McNeilus. De auteurs willen Hyungsoon Im bedanken voor hulp bij illustraties en Shailabh Kumar voor hulp bij scanning elektronenmicroscopie.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
