Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo
Summary
Bicamadas lipídicas suportadas e partículas de membranas naturais são sistemas convenientes que podem aproximar as propriedades das membranas celulares e ser incorporadas em uma variedade de estratégias de análise. Aqui demonstramos um método para a preparação de compostos de microarrays de suporte revestidas de lípidos em bicamada-SiO 2 grânulos, vesículas de fosfolípidos ou partículas de membranas naturais.
Abstract
Membranas de bicamada lipídica formar as membranas plasmáticas de células e definir os limites de organelos subcelulares. Na natureza, estas membranas são misturas heterogéneas de vários tipos de lípidos, contêm proteínas ligadas à membrana, e são decorados com hidratos de carbono. Em algumas experiências, é desejável para dissociar as propriedades biofísicas ou bioquímicas da bicamada lipídica dos da membrana natural. Tais processos requerem o uso de sistemas modelo tais como vesículas gigantes, lipossomas ou bicamadas lipídicas suportados (EBSL). Matrizes de EBSL são particularmente atraentes para aplicações de detecção e imitando interações célula-célula. Aqui nós descrevemos um novo método para a formação de matrizes SLB. Submicron diâmetro SiO 2 grânulos são primeiro revestidas com camadas duplas de lípido para formar EBSL esféricas (SSLBs). Os grânulos são, em seguida, depositada numa matriz de micropoços micro fabricado submícron de diâmetro. A técnica de preparação utiliza um "rodo" para limpar a superfície do substrato, enquanto deixandog trás SSLBs que se instalaram em micropoços. Este método não requer nenhuma modificação química do substrato de micropoços, nem quaisquer ligandos alvo particulares no SSLB. Os micropoços são ocupados por grânulos individuais, porque o diâmetro do poço é ajustado para ser apenas maior do que o diâmetro do cordão. Tipicamente, mais de 75% dos poços estão ocupados, enquanto o restante permanece vazio. Em tampão de matrizes SSLB exibir estabilidade a longo prazo maior do que uma semana. Vários tipos de SSLBs podem ser colocados em uma única matriz pela deposição de série, e as matrizes podem ser usados para a detecção, o que demonstramos ao caracterizar a interação da toxina da cólera com gangliosídeo GM1. Mostramos também que as vesículas de fosfolípidos, sem os suportes de talão e biomembranas de fontes celulares podem ser dispostos com o mesmo método e os lípidos da membrana específicos para células podem ser identificadas.
Introduction
Membranas lipídicas bicamada são estruturas essenciais na natureza. Membranas plasmáticas celulares e membranas de organelas são compostas por bicamadas lipídicas que incorporam uma série de moléculas que são necessárias para a vida. Muitos processos que sustentam a vida ocorrem na superfície de células ou são mediadas por moléculas associadas com membranas de bicamada lipídica. De facto, muitos processos farmacêuticos alvo ou moléculas são encontrados sobre ou dentro de membranas de 1,2. Por conseguinte, é necessário investigar analiticamente processos, tais como reacções químicas ou eventos de ligação não covalentes que ocorrem sobre as superfícies da membrana. Porque as membranas naturais podem ser difíceis de isolar e / ou de interface com os sensores, muitos investigadores empregam membranas modelo simplificado para a realização de estudos analíticos. Um certo número de sistemas de membranas modelo são descritos na literatura, variando a partir de vesículas gigantes que podem ser dezenas a centenas de microns de diâmetro até os lipossomas com dimensões nanométricas 3,4. Alterntivamente, bicamadas lipídicas planas depositados em suportes sólidos, isto é, suportadas bicamadas lipídicas (EBSL), pode ser formado de uma série de superfícies diferentes e têm sido amplamente utilizados em biofísicos, bioquímicos, e aplicações analíticas 5. Acoplamento EBSL com materiais eléctricos ou ópticos permite a investigação de bioquímica e biofísica da membrana, através da utilização de diferentes técnicas analíticas. A microscopia de fluorescência 6, 7 eletroquímica, espectroscopia óptica 8, microscopia de varredura por sonda 9, a ressonância de plasma de superfície 10, e espectrometria de massa 11 têm sido utilizados para estudar a estrutura e propriedades de EBSL.
Matrizes SLB oferecem versatilidade adicional na concepção de sensores para ensaios multiplex 12,13. Outras aplicações utilizam matrizes SLB para imitar a junção que se forma entre células do sistema imunológico 14. Métodos de preparação para matrizes SLB têm variado de microfluidic se aproxima de 15 a aqueles que empregam as barreiras físicas entre os patches SLB adjacentes. 16 Outros grupos têm usado métodos de impressão 17, padronização fotoquímica 18 e vários nanoengineering se aproxima de 19 a criar matrizes SLB.
Neste artigo e vídeo que acompanha demonstramos um método para formar matrizes SLB SLB depositando-revestidos SiO 2 contas em conjuntos ordenados de micropoços 20. Referimo-nos aos SLB-revestidos SiO 2 pérolas esféricas como bicamadas lipídicas suportadas (SSLBs). Esta técnica é uma extensão do trabalho anterior que criou conjuntos de vesículas de fosfolipídios e biomembranas derivados de fontes naturais 21, de onde também mostram exemplos de resultados. Outros métodos para arraying partículas de membranas ou vesículas têm contado com padrões de ligantes específicos de segmentação em superfícies que se associam com ligantes complementares contidas na superfície da vesícula. Exemplos incluem a biotina-associação avidina 22,23 e esquemas de hibridização DNA 24. Nossa abordagem requer apenas uma matriz de micropoços sem partes necessárias de segmentação ou de reconhecimento. O tamanho de SSLBs é definida pelo diâmetro das SiO 2 suportes de talão, que têm baixa poli-dispersividade. Ao ajustar o diâmetro de micropoços apenas maior que o diâmetro SSLB, apenas um único SSLB depositada em cada microplaca. Um poli (dimetilsiloxano) (PDMS) rodo então remove da superfície de todos os SSLBs que não estão imobilizados em micropoços. Os micropoços e matrizes SSLB resultantes têm elevada densidade (~ 10 5 SSLBs / mm 2) com 3 um espaçamento centro-a-centro e periodicidade hexagonal. Por serialmente depositando SSLBs com diferentes composições de lípidos, é possível criar matrizes de múltiplos componentes com SSLBs posicionados aleatoriamente. Para demonstrar a capacidade de detecção de matrizes SSLB, usamos a interação da toxina da cólera (CTx) com um gangliosídeo (GM1) incorporada nas SSLBs. Compartículas de membranas naturais, que eram capazes de detectar lípidos específicos de células em matrizes de multicomponentes que contenham material de membrana a partir de dois tipos de células diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho é mostrar que monodispersas SiO 2 contas revestidas com camadas duplas lipídicas suportados podem ser dispostos em conjuntos de micropoços, sem a necessidade de ligandos alvo nas bicamadas lipídicas ou a superfície do substrato, e as matrizes podem ser usadas para caracterizar as interacções lípido-toxina. A nós constante de dissociação calculada para a ligação CTx/GM1 compara favoravelmente, dada a grande disparidade de valores na literatura, com um relatório anterior por Winter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios a SHO dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 GM092993), a Fundação Nacional de Ciência (NSF CARREIRA Award e DBI 0.964.216), o Escritório de Pesquisa Naval (ONR) Programa Jovem Pesquisador eo Prêmio Parceria Minnesota de Biotecnologia e Genômica Médica. Fabricação de dispositivos foi realizada na Universidade de Minnesota Nanofabricação Center (NFC), que recebe o apoio da NSF por meio da Rede de Infra-estrutura Nacional de Nanotecnologia. Este trabalho também foi apoiado por subsídios para MR dos Institutos Nacionais de Saúde (NS048357, R21 NS073684), a National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), o Applebaum, Hilton, Peterson e Sanford Fundações ea família McNeilus. Os autores agradecem a Hyungsoon Im de assistência com ilustrações e Shailabh Kumar de assistência com microscopia eletrônica de varredura.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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