スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成
Summary
サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO 2ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。
Abstract
脂質二分子膜は、細胞の原形質膜を形成し、細胞内オルガネラの境界を画定する。自然界では、これらの膜は、脂質の多くの種類の不均質混合物である膜結合タンパク質を含んでおり、糖質が飾られています。いくつかの実験では、天然のものから、膜の脂質二重層の生物物理学的又は生化学的特性を分離することが望ましい。そのような場合には、このような巨大ベシクル、リポソームまたはサポートされている脂質二重層（のSLB）などのモデルシステムの使用を求める。のSLBのアレイは、アプリケーションを検出し、細胞 – 細胞相互作用を模倣するために特に魅力的である。ここでは、SLBアレイを形成するための新たな方法を説明します。サブミクロン径のSiO 2ビーズが第1の球面のSLB（SSLBs）を形成する脂質二重層で被覆されている。次いで、ビーズを微細加工サブミクロン径のマイクロウェルのアレイに堆積される。別れるながら調製技術は、基板表面を洗浄するために「スキージ」を使用しマイクロウェルに落ち着いてきSSLBsの後ろグラム。この方法は、マイクロウェル基板のない化学修飾、またSSLB上の任意の特定の標的化リガンドを必要としません。ウェルの直径は、ビーズの直径よりもわずか大きくなるようにチューニングされているので、マイクロウェルは単一のビーズによって占有されている。残りは空のままで一般的には、井戸のより多くの75％は、占有されている。緩衝液中でSSLBアレイは、より大きな一週間の長期安定性を示す。我々は、ガングリオシドGM1とコレラ毒素の相互作用を特徴付けることによって実証する、SSLBs複数種類のシリアル堆積によって単一のアレイに配置することができ、およびアレイは、感知のために使用することができる。我々はまた、細胞源からビーズ支持体と生体膜なしのリン脂質小胞は、同じ方法で配列することができ、細胞特異的膜脂質を同定することができることを示している。
Introduction
脂質二重膜は、本質的に必須の構造である。携帯形質膜や細胞小器官の膜は、生活のために必要である分子の数を組み込んだ脂質二重層で構成されています。多くの生命維持プロセスは、細胞の表面に発生するか、脂質二重膜と結合する分子によって媒介される。実際には、多くの医薬品対象プロセスまたは分子は、1,2または膜上に見出される。これは、分析的に、膜表面で起こる化学反応または非共有結合事象のようなプロセスを調査することが必要である。天然の膜は、単離することが困難および/またはセンサとのインタフェースとすることができるので、多くの研究者が分析研究を実施するために簡略化されたモデル膜を用いる。モデル膜システムの数は、数十ナノスケール寸法を有するリポソーム3,4に直径数百ミクロンにすることができる巨大な小胞に至るまで、文献に記載されている。 ALTERNatively、固体支持体上に堆積された平面脂質二重層は、 すなわち 、異なる表面の数に形成することができ、広く、生物物理学的、生化学的、および分析アプリケーション5で使用されているが、脂質二重層（のSLB）を支持した。電気的または光学材料でのSLBとを連結すると、さまざまな分析技術を利用して膜生化学および生物物理学の研究を可能にします。蛍光顕微鏡6、7電気化学、光学分光8、走査型プローブ顕微鏡法9、表面プラズモン共鳴10、および質量分析11は、すべてのSLBの構造と特性を研究するために使用されてきた。
SLBアレイは多重アッセイ12,13のためのセンサーの設計に追加の汎用性を提供します。他のアプリケーションは、免疫細胞14の間に形成される接合を模倣するために、SLBアレイを使用しています。 SLBアレイの製造方法は、microfluから変化しているIDICは、隣接のSLBパッチ間の物理的な障壁を用いるものと15に近づく。16他のグループが印刷方法17を使用していた、光化学パターニング18と、様々なナノエンジニアリングは、SLBアレイを作成するために19に近づく 。
本論文では、添付のビデオでは、マイクロウェル20の順序付き配列にSLBでコーティングされたSiO 2ビーズを堆積させることにより、SLBアレイを形成する方法を示しています。私たちは、球状の支持された脂質二重層（SSLBs）などのSLBでコーティングされたSiO 2ビーズを参照してください。この技術は、我々はまた、例の結果を示し、そこから自然発生源21に由来リン脂質小胞と生体膜の配列を作成した初期の研究の延長である。生体粒子または小胞を配列するための他の方法は、小胞の表面上に含まれる相補的なリガンドと会合する表面上の特定の標的化リガンドのパターンに頼ってきた。例としては、ビオチンを含んでアビジン会合22,23及びDNAハイブリダイゼーションスキーム24。我々のアプローチは、必要のない標的化または認識部分を有するマイクロウェルアレイを必要とします。 SSLBsのサイズは、低多分散性を持ったSiO 2ビーズ支持体の直径によって定義されます。 SSLBの直径よりも大きいだけに、マイクロウェルの直径を調整することによって、単一SSLBは、各マイクロウェルに落ち着く。ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）スキージはその後、表面からマイクロウェル中に固定化されていないすべてのSSLBsが削除されます。得られたSSLBマイクロウェルアレイは、3μmの中心間間隔および六角形の周期性を有する高密度（〜10 5 SSLBs個/ mm 2）を有する。直列異なる脂質組成物でSSLBsを堆積させることによって、それがランダムに配置SSLBsを有する多成分アレイを作成することができる。 SSLBアレイの感知能力を実証するために、我々はSSLBsに組み込まガングリオシド（GM1）でコレラ毒素（CTX）の相互作用を用いる。とともに天然の膜粒子は、我々は2つの異なる種類の細胞からの膜材料を含む多成分アレイにおいて、細胞特異的脂質を検出することができた。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、支持された脂質二分子層で被覆された単分散SiO 2のビーズは、脂質二重層または基板表面にリガンドを標的化するための必要なしにマイクロウェルアレイに配列することができ、アレイは、毒素-脂質相互作用を特徴づけるために使用することができることを示している。我々はCTx/GM1結合に計算された解離定数は冬らの以前の報告。、脂質でコーティングしたビー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所（R01 GM092993）からSHOの補助金によって支えられて、全米科学財団（NSFキャリア賞、DBI 0964216）、米海軍研究局（ONR）若手研究プログラムとバイオテクノロジーのためのミネソタパートナーシップ賞医療ゲノミクス。デバイス製造は、国家ナノテクノロジー基盤ネットワークを介してNSFの支援を受けてミネソタ大学のナノファブリケーションセンター（NFC）、で行った。この作品はまた、国立衛生研究所（NS048357、R 21 NS073684）、国立多発性硬化症協会（CA1060A11）、アップルバウム、ヒルトン、ピーターソンとフォード財団やMCNEILUSファミリーからMRに補助金によって支えられている。著者らは、走査型電子顕微鏡の支援のためのイラストやShailabhクマーの支援についてはHyungsoonイムに感謝したいと思います。
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
